Il metodo MPN (Most Probable Number) è una prova presuntiva che si effettua inoculando il campione da esaminare in una serie di tubi contenenti terreno liquido.
Il sistema più utilizzato è quello detto ‘simmetrico’ ed impiega lo stesso numero di tubi per ogni diluizione del campione in esame (solitamente si usano 3 o 5 tubi per diluizione)
I tubi con il campione e il terreno appropriato vengono messi ad incubare in termostato o in bagnomaria secondo i tempi e le temperature richiesti, quindi si passa alla lettura identificando i tubi positivi di tre diluizioni successive significative (la positività dipende dal terreno e dalla reazione richiesta). A questi si assegna il valore 1 mentre a quelli negativi si da valore 0, dopodichè si sommano i valori ottenuti per ogni gruppo di 3 o 5 tubi alla stessa diluizione e si confrontano con le tabelle di Mac Crady. Moltiplicando il valore corrispondente delle tabelle per l’inverso del fattore di diluizione si risale al numero presuntivo di colonie presenti nel campione iniziale espresso in MPN/g o ml
I coliformi sono dei Gram negativi appartenenti alla famiglia delle Enterobacteriaceae. Hanno forma di bastoncello e fermentano il lattosio a 37°C con produzione di gas e acido.
I coliformi totali possono essere sia di derivazione fecale che ambientale. Sono diffusi nel suolo, sulle piante, nell’aria e nell’acqua. A questo gruppo molto eterogeneo appartengono vari generi principalmente Escherichia, Citrobacter, Enterobacter e Klebsiella, ma anche altri enterobatteri che seppur non fermentando lattosio (non sono lattosio positivi) possono essere patogeni per l’uomo (Yersinia, Shigella, ecc)
I coliformi fecali invece rappresentano quella frazione di coliformi totali che sono di indubbia origine fecale e fermentano lattosio a 44°C in 24 ore. Appartengono a questo gruppo i generi Escherichia, Klebsiella, Enterobacter e Citrobacter.
Il D.Lgs 31/2001 pone Escherichia coli come indicatore di contaminazione fecale delle acquepotabili, in quanto esso è presente in elevata quantità nelle feci umane ed animali, è facilmente isolabile in terreni di coltura e si sviluppa rapidamente.
Il BGBB o Brilliant Green Bile (2%) Broth, è un brodo di coltura selettivo utilizzato per l’identificazione dei coliformi fecali nelle acque, negli alimenti e nei liquami.
Per la ricerca di Escherichia coli il BGBB inoculato con le colonie sospette, viene incubato a 44°C per 18 ore. Si osserva poi se il brodo è diventato torbido per la crescita microbica e si controlla se è presente gas accumulato nella campanella di Durham all’interno della provetta. E’ possibile effettuare in parallelo un ulteriore test di conferma per la presenza di Escherichia coli tramite una prova per la produzione di indolo che si effettua utilizzando acqua o brodo triptonato e reattivo di Kovacs.
Controllo negativo, Proteus vulgaris, Escherichia coli