{"id":3043,"date":"2008-05-28T00:00:00","date_gmt":"2008-05-27T22:00:00","guid":{"rendered":""},"modified":"-0001-11-30T00:00:00","modified_gmt":"-0001-11-29T22:00:00","slug":"3043","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.vialattea.net\/content\/3043\/","title":{"rendered":"Vorrei sapere la storia della tecnica molecolare ibridazione in situ"},"content":{"rendered":"

L’ibridazione in situ<\/em> (ISH) è una tecnica sviluppata a partire dalla fine degli anni Sessanta che permette di determinare e quantificare la presenza di specifiche sequenze di DNA o RNA all’interno di un dato campione. <\/font><\/p>\n

 Il concetto sul quale si basa la tecnica è il seguente: conoscendo la sequenza di DNA o RNA d’interesse, si può verificare la presenza di tali sequenze in un dato campione costruendo delle “sonde”, cioè delle sequenze polinucleotidiche complementari a singolo filamento, che si possano appaiare (“ibridare”) alle regioni corrispondenti. Ovviamente queste sequenze devono essere sufficientemente lunghe da escludere appaiamenti fittizi e l’avvenuto appaiamento deve essere facilmente riconoscibile. Il primo metodo efficace di ibridazione in situ<\/em>Southern blot<\/em>): <\/font>fu messo a punto da Southern nel 1975, da cui l’omonima tecnica.<\/font> <\/o:p><\/font><\/o:p><\/font><\/p>\n

    \n
  1. il DNA, dopo essere stato separato in base alla massa molecolare tramite gel-elettroforesi, è trasferito su filtro di nitrocellulosa; <\/font><\/li>\n
  2. viene poi aggiunta in eccesso la sonda, che in questo metodo di dosaggio è marcata radioattivamente al livello del P dei nucleotidi (32<\/sup>P), in condizioni tali che sia in singola elica e possa appaiarsi al campione;<\/font><\/li>\n
  3. viene infine effettuato un lavaggio, in modo da eliminare la sonda che non si è legata e, tramite metodi di misura della radioattività (scintillazione, autoradiografia), si può valutare l’eventuale presenza del DNA d’interesse e, a seconda dell’intensità del segnale, la quantità di DNA presente nel campione. La stessa tecnica venne successivamente modificata, utilizzando sonde a RNA, per poterla applicare anche all’RNA, e prese il nome di Northern blot<\/em>.<\/font><\/li>\n<\/ol>\n

     Poichè lavorare con materiale radioattivo comporta notevoli costi, relativi sia allo smaltimento dei rifiuti e che alla sicurezza dei lavoratori, sono state sviluppate negli anni Ottanta delle tecniche che risolvessero il problema. Un primo tipo di tecniche è definito sistemi di misura indiretta non radioattiva: i nucleotidi della sonda vengono modificati con una molecola utilizzata per accoppiare l’avvenuta ibridazione con una reazione enzimatica, fotochimica o di sintesi chimica facilmente rilevabile. Le molecole più utilizzate sono biotina, dinitrofenolo, bromodeossiuridina, digossigenina o DIG, ma in generale come caratteristiche non devono essere presenti con gli acidi nucleici o reagire con essi. Ad esempio, nel caso della biotina, i nucleotidi usati per le sonde sono collegati alla biotina da ponti di 4-14 atomi di carbonio, senza che creino ingombro sterico. Dopo l’ibridazione e il trasferimento su membrana, il campione biotinilato è rilevato mediante l’utilizzo di streptavidina, una proteina ad altissima affinità per la biotina, coniugata con un enzima, capace d’idrolizzare un substrato cromogenico, fluorogenico o chemiluminescente. Molto spesso a tal scopo come enzima è usata la fosfatasi alcalina, che è capace d’idrolizzare il p<\/em>-nitrofenilfosfato a paranitrofenolo, che è un composto cromogeno la cui formazione può essere seguita spettrofotometricamente nel tempo; poiché l’ibridazione non è rilevata direttamente dal DNA, ma grazie ad un sistema collegato ad esso, vale a dire l’enzima e la molecola segnale, si parla appunto di metodi indiretti. Per quanto riguarda i composti fluorofori, invece, è utilizzato, sempre accoppiato alla fosfatasi alcalina, l’HNPP, che dopo la defosforilazione genera un precipitato fluorescente, che si eccita a 290 nm ed emette a 509 nm; questo tipo di saggio è più sensibile di quelli colorimetrici. Quando è utilizzata una sostanza fluorescente, l’ISH viene chiamata FISH. Infine, a proposito dei dosaggi chemiluminescenti, è spesso usato l’enzima perossidasi di rafano (HRP) accoppiato al luminol (5-ammino-2,3-diidro-1,4-ftalazindione): se ossidato in presenza di perossido, il luminol dà origine ad una molecola che emette luce a 425 nm durante la sua decomposizione allo stato fondamentale. In tutti questi casi è necessario comunque un sistema di quantificazione dell’intensità del segnale, in genere fornito dalle case produttrici dei kit.<\/font><\/o:p><\/font><\/p>\n

    Infine, esistono anche altri metodi, detti diretti, nei quali gli acidi nucleici sono marcati direttamente con molecole fluorescenti, come la fluoresceina o rodamina, oppure con enzimi (fosfatasi, perossidasi); anche in questo caso, la presenza di questi addotti legati covalentemente può essere quantificata mediante le tecniche precedentemente elencate.<\/font><\/p>\n

     <\/o:p><\/span><\/font><\/p>\n

    Fonti:<\/o:p><\/span><\/font><\/p>\n

    “Molecular cloning: a laboratory manual”, Sambrock and Russell, CSHL Press<\/o:p><\/span><\/font><\/p>\n

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    Risposte precedenti in Vialattea:<\/o:p><\/span><\/font><\/p>\n

    http:\/\/www.vialattea.net\/esperti\/php\/risposta.php?num=10733<\/span><\/a><\/span><\/font> <\/font>per le tecniche di biologia molecolare;<\/o:p><\/span><\/font><\/pre>\n
    http:\/\/www.vialattea.net\/esperti\/php\/risposta.php?num=6355<\/a><\/span><\/font> per quanto riguarda la FISH<\/st1:personname>.<\/span><\/font><\/o:p><\/span><\/pre>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
    […]<\/p>\n","protected":false},"author":283,"featured_media":0,"comment_status":"closed","ping_status":"open","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":{"footnotes":""},"categories":[28],"tags":[],"class_list":["post-3043","post","type-post","status-publish","format-standard","hentry","category-biologia-molecolare-e-genetica"],"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/www.vialattea.net\/content\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/3043","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/www.vialattea.net\/content\/wp-json\/wp\/v2\/posts"}],"about":[{"href":"https:\/\/www.vialattea.net\/content\/wp-json\/wp\/v2\/types\/post"}],"author":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.vialattea.net\/content\/wp-json\/wp\/v2\/users\/283"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.vialattea.net\/content\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=3043"}],"version-history":[{"count":0,"href":"https:\/\/www.vialattea.net\/content\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/3043\/revisions"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/www.vialattea.net\/content\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=3043"}],"wp:term":[{"taxonomy":"category","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.vialattea.net\/content\/wp-json\/wp\/v2\/categories?post=3043"},{"taxonomy":"post_tag","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.vialattea.net\/content\/wp-json\/wp\/v2\/tags?post=3043"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}