{"id":2760,"date":"2006-11-12T00:00:00","date_gmt":"2006-11-11T23:00:00","guid":{"rendered":""},"modified":"-0001-11-30T00:00:00","modified_gmt":"-0001-11-29T22:00:00","slug":"2760","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.vialattea.net\/content\/2760\/","title":{"rendered":"Volevo sapere cosa sono i sistemi di espressione (sia procariotici che eucariotici) applicati alle biotecnologie. Grazie per il vostro aiuto"},"content":{"rendered":"

I sistemi d\u2019espressione sono degli strumenti biotecnologici utilizzati per ottenere larghe quantit\u00e0 di proteine pure, generalmente importanti dal punto di vista terapeutico, commerciale o della ricerca di base. I vantaggi di questo approccio, rispetto a tecniche pi\u00f9 tradizionali come la purificazione di proteine dal loro tessuto d\u2019origine, sono essenzialmente la rapidit\u00e0, la resa, la sicurezza e la flessibilit\u00e0.
In poche parole, si tratta d\u2019inserire il gene codificante la proteina d\u2019interesse all\u2019interno di una \u201ccellula ospite\u201c batterica (procariote), di lievito o di mammifero (eucarioti). Questo DNA estraneo deve essere inoltre posto sotto il controllo di un elemento genetico (il promotore) in grado di essere riconosciuto dalla cellula ospite. La cellula cos\u00ec \u201cingegnerizzata\u201d produrr\u00e0 la proteina d\u2019interesse durante la sua fase di crescita, generalmente in quantit\u00e0 molto superiori a quelle rinvenibili naturalmente, facilitando cos\u00ec le successive fasi di purificazione. Le linee cellulari ingegnerizzate possono inoltre essere \u201ccoltivate\u201d in laboratorio in fermentatori da centinaia di litri, il che spiega le alte rese ottenibili. E\u2019 inoltre forse utile specificare che, mentre per l\u2019espressione di proteine batteriche si prediligono sistemi procariotici, le proteine eucariotiche possono essere espresse sia in sistemi eucariotici sia in sistemi procariotici.
Sino a qualche decina d\u2019anni fa, i sistemi d\u2019espressione procariotici erano pressoch\u00e8 limitati al batterio Escherichia coli<\/em>. Oggi, il progresso nella conoscenza della genetica batterica ha reso possibile l\u2019utilizzo di altre specie e sistemi d\u2019espressione basati su Bacillus subtilis<\/em> e, specialmente, Lactococccus lactis<\/em> sono attualmente disponibili. E. coli<\/em> cresce facilmente in laboratorio, duplicandosi rapidamente (nelle migliori condizioni circa ogni 20\u2019-30\u2019); l\u2019approfondita conoscenza della sua genetica e fisiologia cellulare e la disponibilt\u00e0 dei necessari strumenti molecolari (promotori e plasmidi) ne hanno storicamente fatto un sistema d\u2019espressione molto conveniente. Poich\u00e8 i procarioti non posseggono il sistema di processamento dell\u2019RNA messaggero tipico degli eucarioti superiori, nel caso la proteina da esprimere sia d\u2019origine eucariotica, \u00e8 essenziale che il DNA che la codifica sia sotto forma di cDNA. Questo cDNA viene inserito (o clonato) sotto il controllo di un promotore batterico al\u2019interno di un vettore d\u2019espressione (vedi http:\/\/www.vialattea.net\/esperti\/php\/risposta.php?num=7013<\/a>), che viene poi a sua volta inserito (o trasformato) in molteplici copie nella cellula batterica. L\u2019espressione della proteina d\u2019interesse viene generalmente indotta ad un appropriato momento della crescita cellulare grazie all\u2019aggiunta al terreno di coltura di composti chimici che stimolano il promotore. La presenza di molte copie del vettore d\u2019espressione in ciascuna cellula e la capacit\u00e0 di E. coli<\/em> di crescere ad alta densit\u00e0 (alto numero di cellule per litro di coltura), ne fanno un sistema d\u2019espressione caratterizzato da una grande resa ed economicit\u00e0. L\u2019esempio forse pi\u00f9 significativo dell\u2019utilizzo di E. coli<\/em> come sistema d\u2019espressione applicato alla biotecnologia \u00e8 quello della produzione d\u2019insulina umana per il trattamento di pazienti diabetici (commercializzata da Eli Lilly con il nome di Humulin). L. lactis<\/em> \u00e8 un microrganismo comunemente usato nell\u2019industria casearia per la conservazione e la fermentazione di latticini. Il suo utilizzo nella filiera alimentare lo rende un batterio generalmente considerato sicuro per l\u2019uomo, da qui l\u2019interesse nel suo sviluppo come sistema per l\u2019espressione di proteine d\u2019importanza terapeutica, come antigeni virali per la produzione di vaccini e citochine umane.
Nonostante la maggior parte delle proteine eucariotiche possano essere espresse in sistemi batterici, esistono eccezioni: per esempio, i procarioti non posseggono membrane intracellulari e non sono quindi generalmente indicati per l\u2019espressione di proteine di membrana. Essi inoltre sono incapaci di portare a termine certe modificazioni a cui alcune proteine eucariotiche vanno naturalmente incontro (per es. la glicosilazione). In questi casi, si preferisce dunque esprimere la proteina eucariotica in un sistema eucariotico, come i lieviti o le cellule di mammifero.
Fra i sistemi d\u2019espressione eucariotici unicellulari, il lievito Saccharomyces cerevisiae<\/em> \u00e8 quello storicamente pi\u00f9 utilizzato. Cos\u00ec come L. lactis<\/em>, S. cerevisiae<\/em> \u00e8 un microrganismo presente nella nostra filiera alimentare (panificazione) e perci\u00f2 considerato sicuro, cresce facilmente nelle condizioni di laboratorio con tempi di duplicazione medi di circa 1- 2 ore, la sua genetica \u00e8 ben conosciuta e numerosi vettori d\u2019espressione sono disponibili. Insomma, pur essendo un eucariote, raggruppa in s\u00e9 molti dei vantaggi dei sistemi d\u2019espressione procariotici. Anche nel caso dei lieviti, il cDNA codificante la proteina d\u2019interesse deve essere preventivamente clonato in un vettore d\u2019espressione (per ragioni di rapidit\u00e0 questo passaggio viene normalmente eseguito in E. coli<\/em>), sotto il controllo di un promotore genico di lievito. Il plasmide viene poi trasferito all\u2019interno della cellula di S. cerevisiae<\/em>. A seconda della sua tipologia, il plasmide potr\u00e0 integrarsi nel cromosoma della cellula (vettore integrativo) o persistere come unit\u00e0 indipendente (vettore episomale). I vettori integrativi sono molto stabili (cio\u00e8 non subiscono rimodellamenti e vengono trasmessi di generazione in generazione assieme al cromosoma cellulare) ma sono presenti in una sola copia per cellula. Al contrario, i vettori episomali sono presenti in molteplici copie per cellula, ma la loro ripartizione da cellula madre a cellula figlia al momento della divisione cellulare non \u00e8 sempre uniforme, col rischio potenziale d\u2019assistere ad un graduale declino del numero di copie col passare delle generazioni. La scelta di un vettore integrativo privilegia dunque la stabilit\u00e0 d\u2019espressione, mentre quella di un plasmide episomale favorisce la resa. Negli ultimi decenni, altre specie oltre a S. cerevisiae<\/em> hanno trovato crescente uso per l\u2019espressione di proteine, in particolare i lieviti metilotrofi (cio\u00e8 capaci d\u2019utilizzare il metanolo come fonte di carbonio) e fra questi Pichia pastoris<\/em>. Il vantaggio di questa specie consiste nella capacit\u00e0 di crescere ad alte densit\u00e0 cellulari su di un terreno di coltura poco costoso, con livelli d\u2019espressione della proteina d\u2019interesse che possono toccare i grammi\/litro. Tra le proteine prodotte a partire da sistemi d\u2019espressione di lievito si trovano antigeni virali e batterici (virus epatite B e C. tetani), citochine e fattori della crescita umani (tumor necrosis factor o TNF; epidermal growth factor o EGF), agenti trombolitici (streptochinasi) e soprattutto una nuova generazione d\u2019insulina a rapida azione (NovoLog, commercializzata da Novo Nordisk).
Le cellule di mammifero sono un sistema d\u2019espressione tecnicamente complesso, costoso, caratterizzato da basse rese e lunghi tempi d\u2019attesa. Esse sono dunque generalmente utilizzate solo in casi particolari, come per la produzione di proteine d\u2019origine umana per le quali sia di primaria importanza che la proteina prodotta sia del tutto simile a quella naturale (es. citocromi P450) o in caso di fallimento dei sistemi batterici e di lievito. Il cDNA codificante la proteina d\u2019interesse deve essere preventivamente clonato o in un vettore d\u2019espressione, che viene poi trasferito (transfettato) nella cellula eucariotica, oppure all\u2019interno del genoma di un virus, che viene poi utilizzato per infettare le cellule. L\u2019espressione della proteina d\u2019interesse pu\u00f2, a seconda del sistema prescelto, avvenire in maniera transitoria o stabile. L\u2019espressione transitoria \u00e8 conseguenza dell\u2019uso di plasmidi d\u2019espressione instabili, che vengono gradualmente perduti dalle cellule (per esempio, vettori contenenti l\u2019origine di replicazione del virus SV40), oppure di virus che, una volta infettate le cellule, finiscono per provocarne la morte (per esempio, vaccinia virus).
L\u2019espressione stabile si ottiene utilizzando vettori d\u2019espressione che persistono indefinitamente all\u2019interno della cellula, sia per integrazione nel cromosoma cellulare sia come entit\u00e0 indipendenti (vettori basati sul virus Epstein-Barr).
Un caso particolare d\u2019uso di cellule di mammifero per la produzione di proteine di grande importanza terapeutica \u00e8 quello degli ibridomi. Gli ibridomi sono linee cellulari ingegnerizzate al fine di produrre anticorpi. Animali da laboratorio vengono esposti all\u2019agente (antigene) contro il quale si vogliono produrre anticorpi. Trascorso il periodo d\u2019immunizzazione, i linfociti di tipo B (naturalmente incaricati della produzione anticorpale) vengono rimossi dalla milza dell\u2019animale e fusi con cellule tumorali di mieloma. In questo modo si ottiene una nuova linea cellulare \u201cibrida\u201d in grado di crescere indefinitamente (caratteristica apportata dalle cellule tumorali) e di produrre anticorpi (caratteristica apportata dai linfociti B). Gli anticorpi cos\u00ec prodotti possono essere isolati e divenire strumenti per il trattamento di malattie del sistema immunitario (per es. leucemie, linfomi, AIDS o per prevenire il rigetto d\u2019organi trapiantati).
Tra i sistemi d\u2019espressione eucariotici ha trovato larghe applicazioni, sinora solo nel campo della ricerca di base, l\u2019utilizzo di cellule d\u2019insetto (solitamente S. frugiperda<\/em>). Il cDNA codificante la proteina d\u2019interesse viene clonato all\u2019interno del genoma di virus specifici (indicati col nome generico di baculovirus), che vengono poi usati per infettare le cellule d\u2019insetto. Questo sistema, come per l\u2019espressione in cellule di mammifero, \u00e8 abbastanza complesso, soprattutto nella fase di generazione dei virus ricombinanti, ma \u00e8 caratterizzato, contrariamente alle cellule di mammifero, da alte rese. <\/p>\n

Mi rendo conto che la risposta possa, in alcuni passaggi, apparire didascalica. Data la vastit\u00e0 della materia ho cercato di riassumere i tratti salienti dei vari sistemi, senza entrare direttamente nei loro aspetti pi\u00f9 tecnici. Spero che questo susciti ulteriori curiosit\u00e0. <\/p>\n

Per approfondire alcuni argomenti (in inglese): <\/p>\n

10 years of the nisin-controlled gene expression system (NICE) in Lactococcus lactis.<\/em> Mierau et al., Appl. Microbiol. Biotechnol.<\/em> (2005), 68<\/strong>, 705-717 <\/p>\n

Recombinant DNA technology as an investigative tool in drug metabolism research. Friedberg & Wolf, Ad. Drug Del. Rev.<\/em> (1996), 22<\/strong>, 187-213 <\/p>\n

Human antibodies for immunotherapy development generated via a human B cell hybridoma technology. Li et al., Proc. Natl. Acad. USA<\/em> (2006), 103<\/strong>, 3557-3562 <\/p>\n

http:\/\/www.immunecentral.com\/immune-system\/iss28.cfm<\/a> <\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"

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