![\"\"\/](\"http:\/\/www.vialattea.net\/spaw\/image\/biologia\/dna_rna.jpg\")
<\/p>\nQuesta domanda, apparentemente cos\u00ec lineare, copre in realt\u00e0 gli ultimi 30 anni di sviluppo tecnico della biologia molecolare. Cercher\u00f2 quindi di dare una risposta esauriente ma necessariamente schematica, lasciando ad ulteriori e pi\u00f9 specifici quesiti il compito di fornire eventuali approfondimenti. <\/p>\n
Gli acidi nucleici sono costituiti da catene di nucleotidi. Ciascun nucleotide contiene una base azotata legata chimicamente ad uno zucchero-fosfato. I due tipi di acido nucleico, DNA ed RNA, differiscono fra loro sia per la composizione in basi azotate (adenina, guanina, citosina e timina per il DNA; adenina, guanina, citosina ed uracile per l\u2019RNA) sia per il tipo di zucchero presente (deossiribosio nel DNA, ribosio nell\u2019RNA). Da un punto di vista strutturale, il DNA \u00e8 una doppia elica contenente due catene di nucleotidi appaiate fra loro (figura 1, appaiamento inter-molecolare).
Questo appaiamento non \u00e8 casuale, ma sfrutta il principio della complementariet\u00e0 fra basi azotate: solo l\u2019adenina si pu\u00f2 trovare di fronte ad una timina e solo la citosina si pu\u00f2 trovare di fronte ad una guanina. Questo principio di complementariet\u00e0 obbligata \u00e8 presente anche nell\u2019RNA: la singola catena di nucleotidi che lo costituisce \u00e8 spesso infatti resa pi\u00f9 stabile da appaiamenti fra basi che si trovano in posizione diverse all\u2019interno dello stesso filamento di acido nucleico (figura 1, appaiamento intra-molecolare). Questo appaiamento \u201cforzato\u201d \u00e8 il presupposto per l\u2019ibridazione specifica degli acidi nucleici. <\/p>\n
<\/p>\n
\u00a0<\/p>\n
La struttura a doppia elica del DNA viene distrutta dal calore: un innalzamento della temperatura fra gli 85 ed i 95 gradi provoca la separazione dei due filamenti contenuti nella doppia elica rendendo il DNA a singola catena (denaturazione). La denaturazione \u00e8 per\u00f2 reversibile: un successivo abbassamento della temperatura permette il riappaiamento dei due filamenti di DNA complementari in un processo noto come rinaturazione. La rinaturazione in provetta fra due molecole di acido nucleico complementari ma provenienti da fonti diverse, per esempio da organismi diversi, viene definita ibridazione (figura 2). <\/p>\n
\u00c8 importante notare come:
1. solo molecole di acido nucleico complementari possano ibridare fra loro (cos\u00ec come solo specifici pezzi di un puzzle possono essere incastrati fra loro)
2. i processi di denaturazione e rinaturazione descritti per il DNA sono validi anche per l\u2019RNA
3. oltre a molecole ibride DNA:DNA, ibridi DNA:RNA sono ugualmente possibili <\/p>\n
![\"\"\/](\"http:\/\/www.vialattea.net\/spaw\/image\/biologia\/ibridazione.jpg\")
<\/p>\n
La tecnica nota come southern blotting<\/strong> prende il nome dal suo inventore, E. M. Southern, e consiste nell\u2019isolare il DNA da un particolare organismo per poi tagliarlo con enzimi detti endonucleasi di restrizione, che lo riducono in frammenti sufficientemente piccoli da poter essere separati fra loro su di un gel d\u2019agarosio (un p\u00f2 come del terriccio passato attraverso un setaccio). Una volta separati sul gel, i frammenti di DNA vengono trasferiti su di un supporto pi\u00f9 stabile, generalmente una membrana di nitrocellulosa o nylon, semplicemente faccendo passare grandi volumi di tampone dal gel verso la membrana (in pratica i frammenti di DNA vengono \u201ctrascinati\u201d dal tampone). I frammenti di DNA vengono quindi \u201clegati\u201d alla membrana tramite calore (baking) o tramite esposizione ai raggi UV (cross-linking). La membrana, che rappresenta una copia-carbone del gel di partenza,\u00a0viene quindi esposta ad una soluzione contenente un piccolo frammento di DNA radioattivo (sonda o \u201cprobe\u201d). \u00c8 importante sottolineare come il DNA venga mantenuto denaturato durante tutta la procedura. Se un DNA complementare alla sonda era presente nel campione di acido nucleico originario, la sonda vi si appaier\u00e0 formando un ibrido la cui presenza pu\u00f2 essere verificata esponendo la membrana ad una lastra autoradiografica. Questo tipo di tecnica viene solitamente usata per determinare la presenza o meno di un determinato gene nel DNA di un certo organismo. <\/p>\n Quando lo stesso tipo di tecnica viene applicata all\u2019RNA, si parla di northern blotting<\/strong>. In questo caso, \u00e8 solitamente l\u2019RNA messaggero a dover essere isolato dal campione cellulare di partenza e corso su di un gel d\u2019agarosio in presenza di urea, una sostanza chimica che rimuove gli appaiamenti intra-molecolari fra basi, mantenendo quindi l\u2019RNA in forma denaturata. Nel caso del northern blotting non si effettua la digestione con endonucleasi, mentre il resto della procedura \u00e8 del tutto paragonabile a quella del southern blotting. Il northern blotting viene solitamente impiegato per verificare il livello di trascrizione di un determinato gene. <\/p>\n Il dot blot<\/strong> pu\u00f2 essere utilizzato sia su campioni di DNA sia su campioni di RNA. In entrambi i casi, gli acidi nucleici del campione di partenza vengono filtrati sottovuoto direttamente sulla membrana. In questo caso, nessuna separazione in base alle dimensioni delle molecole di acido nucleico \u00e8 dunque prevista. La membrana viene quindi esposta alla sonda marcata radioattivamente. Un\u2019eventuale ibridazione viene quindi determinata tramite autoradiografia. Poich\u00e8 il dot blot richiede un numero inferiore di manipolazioni rispetto alle due tecniche precedenti, esso permette una maggiore velocit\u00e0 d\u2019esecuzione e la contemporanea analisi di un maggior numero di campioni. Il dot blot \u00e8 una tecnica soprattutto quantitativa che permette di determinare, per esempio, il numero di copie di un certo gene presenti in un determinato genoma o la quantit\u00e0 di un certo RNA cellulare. <\/p>\n Southern, northern e dot blotting sono tecniche classiche, sviluppate negli anni \u201970 e \u201980 e tuttora utilizzate ma che consentono l\u2019analisi di un numero limitato di campioni. In anni pi\u00f9 recenti, il completo sequenziamento del genoma umano e di quello di altre specie ha aperto la strada a quella branca della biologia molecolare nota come genomica.<\/p>\n La necessit\u00e0 d\u2019assegnare una funzione a ciascuno delle migliaia di geni identificati grazie alla genomica ha reso indispensabile tecniche che permettano l\u2019analisi simultanea di moltissimi campioni. I macro- e micro-array rispondono a questa esigenza. Le due tecnologie, identiche nel principio, differiscono nel numero di geni simultaneamente analizzabili (da qualche centinaia a qualche migliaia per i macro-array; da diverse migliaia a interi genomi per i micro-array) e nel tipo di supporto utilizzato (classiche membrane di nitrocellulosa o nylon per i macro-array; supporti o \u201cchip\u201d in vetro o altro materiale inerte per i micro-array). Corti frammenti di acidi nucleici (\u201coligonucleotidi\u201d della lunghezza compresa fra poche decine e qualche centinaia di paia di basi) corrispondenti ad un particolare tratto della sequenza dei geni presenti in un particolare tipo di cellula vengono immobilizzati in maniera ordinata e sistematica in punti precisi (o \u201cspot\u201d) del supporto prescelto. Il numero di geni rappresentati \u00e8 quindi funzione della densit\u00e0 degli \u201cspot\u201d genici sul supporto (figura 3). <\/p>\n \u00a0<\/p>\n Ammettiamo si voglia ad esempio verificare l\u2019effetto di un particolare farmaco su di un determinato tipo di cellule. Si tratteranno le cellule in questione con diversi dosaggi del farmaco, avendo cura di avere un campione con cellule non trattate (controllo positivo). Si prepareranno estratti di RNA massaggero da ciascun campione cellulare. Questi RNA messaggeri verrano poi trasformati in provetta in molecole di DNA ad essi complementari (cDNA), i quali verranno quindi marcati con isotopi radioattivi o con sostanze fluorescenti. Questi preparati saranno quindi usati come sonde ed ibridati al tipo di supporto prescelto (macro- o micro-array). L\u2019analisi eseguita a fine ibridazione potr\u00e0 rivelare che un certo numero di spot sul supporto sono ora piu\u2019 radioattivi o piu\u2019 fluorescenti rispetto a quanto evidenziato dal controllo positivo. Questi spot corrispondo a quei geni la cui espressione \u00e8 stata in qualche modo alterata (stimolata o inibita) dal trattamento col farmaco. <\/p>\n Questa branca della biologia molecolare chiamata genomica funzionale \u00e8 un settore in fortissima espansione, il che fa si che numerose aziende siano oggi in grado di fornire sia macro- sia micro-array gi\u00e0 pronti per l\u2019ibridazione, risparmiando cos\u00ec al ricercatore tutte le fasi di preparazione del supporto. <\/p>\n Venendo ora alla seconda parte della domanda, la real-time PCR<\/strong> (o PCR in tempo reale) \u00e8 un\u2019estensione della tecnologia di PCR classica (per una spiegazione della quale si rimanda a questa risposta gi\u00e0 presente nell\u2019archivio del nostro sito http:\/\/www.vialattea.net\/esperti\/php\/risposta.php?num=7684<\/a>). Mentre nella PCR classica, lo sperimentatore pu\u00f2 verificare solo alla fine dell\u2019esperimento il risultato dell\u2019amplificazione, la real-time PCR consente di seguire l\u2019evolversi della reazione in tempo reale, garantendo una maggiore flessibilit\u00e0, una migliore interpretazione dei risultati ed una pi\u00f9 semplice ed affidabile quantificazione degli stessi. Tipicamente, il parametro che viene misurato nella real-time PCR \u00e8 un\u2019aumento di fluorescenza: oltre ai due primer necessari per l\u2019amplificazione, \u00e8 presente nella reazione una sonda complementare al DNA o cDNA da amplificare. La sequenza della sonda viene scelta in modo tale che ibridizzi sul DNA\/cDNA stampo all\u2019interno delle posizioni occupate dai due primers. Questa sonda \u00e8 marcata ad una estremit\u00e0 con un fluoroforo, una sostanza che eccitata con luce di una particolare lunghezza d\u2019onda diviene fluorescente. All\u2019estremit\u00e0 opposta a quella del fluoroforo, la sonda porta un \u201cquencher\u201d, una molecola che, quando \u00e8 vicina al fluoroforo, \u00e8 in grado d\u2019assorbirne la fluorescenza (figura 4). <\/p>\n All\u2019inizio della reazione, la sonda ibridizza al DNA\/cDNA stampo ma nessuna fluorescenza pu\u00f2 essere misurata perch\u00e8 il quencher funziona da \u201cspugna\u201d, assorbendo l\u2019emissione del fluoroforo. Col procedere della reazione di copiatura dello stampo a partire dal primer, per\u00f2, la sonda viene gradualmente scalzata dallo stampo e degradata nei singoli nucleotidi che la costituiscono. Questo significa che ora il quencher non si trova pi\u00f9 sufficientemente vicino al fluoroforo per assorbirne l\u2019emissione e, di conseguenza, si assister\u00e0 ad un aumento della fluorescenza che sar\u00e0 proprozionale all\u2019efficienza dell\u2019amplificazione dello stampo. Inoltre, se nel campione originario erano presenti solo poche molecole del DNA\/cDNA stampo si assister\u00e0 ad un aumento di fluorescenza pi\u00f9 limitato rispetto a quello ottenibile per un campione dove il DNA\/cDNA stampo era presente in un maggiore numero di copie. Questo consente di trasformare le variazioni di fluorescenza misurate durante l\u2019amplificazione in una quantificazione dell\u2019abbondanza del DNA\/cDNA stampo nel campione in analisi. Poich\u00e8 diversi fluorofori sono disponibili con emissione di fluorescenza a lunghezze d\u2019onde diverse fra loro, \u00e8 inoltre possibile seguire l\u2019amplificazione in tempo reale di diversi stampi direttamente nella stessa provetta. Sostalziamente, la real-time PCR consente una pi\u00f9 veloce e pi\u00f9 affidabile quantificazione dell\u2019espressione genica, rispetto a quanto ottenibile con tecniche classiche come il northern blotting. <\/p>\n Per ulteriori approfondimenti (in italiano): e in inglese: http:\/\/www.clinical-virology.org\/anim\/anim_pcr.html<\/a> […]<\/p>\n","protected":false},"author":154,"featured_media":0,"comment_status":"closed","ping_status":"open","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":{"footnotes":""},"categories":[28],"tags":[],"class_list":["post-2649","post","type-post","status-publish","format-standard","hentry","category-biologia-molecolare-e-genetica"],"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/www.vialattea.net\/content\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/2649","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/www.vialattea.net\/content\/wp-json\/wp\/v2\/posts"}],"about":[{"href":"https:\/\/www.vialattea.net\/content\/wp-json\/wp\/v2\/types\/post"}],"author":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.vialattea.net\/content\/wp-json\/wp\/v2\/users\/154"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.vialattea.net\/content\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=2649"}],"version-history":[{"count":0,"href":"https:\/\/www.vialattea.net\/content\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/2649\/revisions"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/www.vialattea.net\/content\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=2649"}],"wp:term":[{"taxonomy":"category","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.vialattea.net\/content\/wp-json\/wp\/v2\/categories?post=2649"},{"taxonomy":"post_tag","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.vialattea.net\/content\/wp-json\/wp\/v2\/tags?post=2649"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}![\"\"\/](\"http:\/\/www.vialattea.net\/spaw\/image\/biologia\/arrays.jpg\")
<\/p>\n![\"\"](\"http:\/\/www.vialattea.net\/spaw\/image\/biologia\/real-time-PCR.jpg\")
<\/p>\n
Benjamin Lewin \u201cIl gene\u201d, Zanichelli
http:\/\/www.molecularlab.it\/didattica\/index.asp<\/a><\/p>\n
T.A. Brown \u201cGene cloning, an introduction\u201d, Chapman & Hall
E.M. Southern \u201cDetection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis\u201d, J. Mol. Biol. (1975), 98, 503-517 <\/p>\n
http:\/\/web.ncifcrf.gov\/rtp\/gel\/rtqpcr\/default.asp<\/a>
http:\/\/pathmicro.med.sc.edu\/pcr\/realtime-home.htm <\/a>
http:\/\/opbs.okstate.edu\/~melcher\/MG\/MGW4\/MG423.html <\/a>
http:\/\/www.accessexcellence.org\/RC\/VL\/GG\/southBlotg.html<\/a>
http:\/\/lifesciences.asu.edu\/resources\/mamajis\/southern\/southern.html <\/a><\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"