{"id":2269,"date":"2005-10-02T00:00:00","date_gmt":"2005-10-01T22:00:00","guid":{"rendered":""},"modified":"-0001-11-30T00:00:00","modified_gmt":"-0001-11-29T22:00:00","slug":"2269","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.vialattea.net\/content\/2269\/","title":{"rendered":"Il polimorfismo delle sequenze palindromi (RFLP), del DNA extragenico minisatellite e microsatellite permette di determinare il grado di parentela tra 2 individui (paternit\u00e0, fratelli), vorrei sapere come variano le sequenze da genitore a figlio, cio\u00e8 rimangono uguali o variano in ripetizioni in tandem o nel caso del RFLP per l’estensione della sequenza."},"content":{"rendered":"

Dato che alcuni argomenti correlati sono gi\u00e0 stati trattati nella nostra rubrica, si rimanda alle risposte corrispondenti per chiarimenti sui termini tecnici:
RFLP: <\/font>http:\/\/www.vialattea.net\/esperti\/php\/risposta.php?num=7066<\/font><\/a> <\/font><\/p>\n

PCR: <\/font>http:\/\/www.vialattea.net\/esperti\/php\/risposta.php?num=7684<\/font><\/a> <\/font><\/p>\n

PCR e test di paternit\u00e0:\u00a0 <\/font>www.vialattea.net\/esperti\/php\/risposta.php?num=8001<\/font><\/a>\u00a0 ; <\/font>http:\/\/www.vialattea.net\/esperti\/bio\/dna\/<\/font><\/a><\/p>\n

Il termine RFLP \u00e8 acronimo dell\u2019inglese Restriction Enzymes Length Polymorphism, che significa “polimorfismo di lunghezza con enzimi di restrizione”. <\/p>\n

Per inciso, gli enzimi di restrizione permettono di tagliare il DNA in frammenti in corrispondenza di specifiche sequenze dette palindromiche, cio\u00e8 che si possono leggere in entrambi i sensi sui due filamenti complementari; per esempio l\u2019enzima BamHI<\/em> riconosce la seguente sequenza (lo slash \/ rappresenta<\/font> il punto di taglio; il colore evidenzia la simmetria nelle sequenze su ciascun filamento e sui\u00a0due filamenti complementari): <\/p>\n

5\u2019… G\u00a0\/ G A<\/font> T C\u00a0\u00a0\u00a0 C<\/font>…3\u2019
3\u2019… C\u00a0\u00a0 C T<\/font> A G\u00a0\/\u00a0 G<\/font>…5\u2019 <\/p>\n

In origine la tecnica RFLP fu messa a punto e utilizzata per evidenziare un polimorfismo consistente nella presenza o assenza di un sito di restrizione, dovuto a mutazioni che vanno a colpire il sito di restrizione stesso facendolo scomparire se esiste, o creandone uno nuovo (1). Successivamente per\u00f2 il termine ha acquisito un significato pi\u00f9 ampio, poich\u00e9 sono stati evidenziati dei tratti di DNA in cui, pur non essendovi mutazioni nei siti di restrizione, vi sono tuttavia polimorfismi di lunghezza dei frammenti. Un\u2019analisi della sequenza di tali frammenti ha messo in luce la presenza di DNA ripetitivo. Attualmente quindi, nel caso di accertamenti di parentela, per RFLP si intende un polimorfismo di lunghezza dovuto a brevi sequenze ripetute in tandem, che essendo molto variabili portano ad un numero cos\u00ec alto di varianti che prendendo due individui dalla stessa popolazione ci si aspetta che questi abbiano la stessa serie di frammenti di restrizione solo se sono consanguinei.<\/font><\/p>\n

\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0 \"\"<\/font><\/p>\n

Esempio di gel in cui sono evidenziatii frammenti RFLP.\u00a0Ogni individuo ha dei frammenti tipici che lo caratterizzano.\u00a0 <\/strong>M = madre;\u00a0 C = figlio; \u00a0AF1= primo uomo; \u00a0AF2= secondo uomo. Il bambino \u00e8 figlio di AF1<\/strong><\/font><\/p>\n

(Per sequenze ripetute in tandem si intende una stessa sequenza ripetuta molte volte di seguito, per esempio: ATGCC ATGCC ATGCC ATGCC , dove ATGCC \u00e8 ripetuta in tandem quattro volte.) <\/p>\n

Naturalmente i tratti di DNA utilizzati nella tecnica RFLP sono molto precisi, e dopo il taglio vengono evidenziati con sonde (frammentini di DNA a singolo filamento e complementari ad una sequenza ricercata) specifiche per il tratto ripetuto. Nell\u2019uomo, gli RFLP usati comunemente per ottenere il profilo genetico di un individuo, (DNA profiling<\/em> o fingerprinting<\/em>, “l\u2019impronta digitale genetica”) si trovano su cromosomi 1, 2, 4, 5, 10 e 17, e le sequenze ripetute sono dei minisatelliti.
Ci\u00f2 che si confronta tra due campioni, per vederne la parentela, sono le bande visibili su un gel e corrispondenti al frammento di restrizione marcato con una sonda radioattiva o luminescente.
I microsatelliti consistono sempre in sequenze ripetute in tandem, ma mentre nei minisatelliti la unit\u00e0 ripetuta \u00e8 composta da 10 a 200 paia di basi, nei microsatelliti \u00e8 pi\u00f9 corta (da cui il nome “micro”) composta da 2 a 6 paia di basi. I microsatelliti vengono analizzati utilizzando l\u2019amplificazione in vitro tramite PCR e andando a vedere quanto \u00e8 lungo il frammento amplificato. Dato che si conosce la sequenza amplificata e la natura della ripetizione, dalla lunghezza del frammento amplificato si pu\u00f2 dedurre quante ripetizioni esso contenga, e quindi di quale variante si tratta.
In ogni caso, trattandosi sempre di sequenze ripetute, in tutti i marcatori menzionati quello che cambia da una variante all\u2019altra (cio\u00e8 da un allele all\u2019altro) \u00e8 sempre il numero di ripetizioni. <\/p>\n

Una curiosit\u00e0
E\u2019 interessante notare che alcuni dei loci minisatellite usati negli RFLP non sono esclusivi dell\u2019uomo, ma sono presenti in tutti i mammiferi e in molti uccelli, e i loci identificati nell\u2019uomo sono utilizzati anche per determinare la parentela in alcune specie animali.
A cosa pu\u00f2 servire ci\u00f2? Per esempio a controllare gli spostamenti di singoli animali attraverso le frontiere. Esiste infatti una convenzione internazionale, la CITES o Convenzione di Washington, che regolamenta il commercio, e il movimento, di certe specie animali attraverso i confini nazionali. Gli animali protetti dalla convenzione e nati in cattivit\u00e0 devono essere certificati, e per far ci\u00f2 si utilizzano anche i marcatori genetici RFLP (2), per dimostrare che, in effetti, un dato individuo \u00e8 figlio di un altro che si trova in cattivit\u00e0. Ogni animale che nasce viene corredato del suo certificato di nascita in cattivit\u00e0, su cui \u00e8 scritto chi sono i genitori e a chi appartengono. Le autorit\u00e0 possono chiedere in qualunque momento un\u2019analisi genetica che dimostri l\u2019effettiva parentela. <\/p>\n

(1) Brettschneider R., 1998. RFLP Analysis. In: Molecular tools for screening biodiversity. Karp, Isaac& Ingram Edts. Chapman and Hall. <\/p>\n

(2) Randi, Tabarroni & Rimondi, 2002. Genetica forense in applicazione alla Convenzione di Washington. Quaderni di Conservazione della Natura, n.12. Ministero Ambiente – Istituto Nazionale per la Fauna Selvatica. <\/p>\n

In questo sito \u00e8 illustrato in modo chiaro e semplice l\u2019analisi delle bande di DNA usate nel metodo RFLP per stabilire la parentela fra individui, anche se \u00e8 in inglese:
<\/font>http:\/\/www.biology.arizona.edu\/human_bio\/activities\/blackett\/introduction.html<\/font><\/a> <\/p>\n

Sul test di paternit\u00e0:
<\/font>http:\/\/www.biology.arizona.edu\/human_bio\/activities\/blackett2\/act_paternity1.html<\/font><\/a>
<\/font>http:\/\/www.laboratoriogenoma.it\/indagini_paternita.asp<\/font><\/a> <\/p>\n

Sul fingerprinting<\/em> genetico:
<\/font>http:\/\/www.anoca.org\/dna\/evidence\/genetic_fingerprinting.html<\/font><\/a>
<\/font>http:\/\/www.bergen.org\/AAST\/Projects\/Gel\/fingprint1.htm<\/font><\/a> <\/font><\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"

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