{"id":1396,"date":"2005-06-10T00:00:00","date_gmt":"2005-06-09T22:00:00","guid":{"rendered":""},"modified":"-0001-11-30T00:00:00","modified_gmt":"-0001-11-29T22:00:00","slug":"1396","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.vialattea.net\/content\/1396\/","title":{"rendered":"Quali sono i campi di utilizzo della PCR (Polymerase Chain Reaction)?"},"content":{"rendered":"

La PCR (Polymerase Chain Reaction<\/em>) \u00e8 una tecnica ideata e messa a punto da Kary B. Mullis nel 1984, il quale ottenne\u00a0per questo il premio Nobel per la chimica nel 1993.\u00a0Questa tecnica\u00a0permette di amplificare e ottenere copie, in numero esponenziale, di frammenti selezionati di acidi nucleici (DNA o RNA) in vitro.
I campi di applicazione\u00a0della PCR\u00a0sono enormi, grazie al fatto che\u00a0qualsiasi\u00a0materiale contenente DNA, come un fossile o tracce di sangue, pu\u00f2 essere utilizzato da stampo per ottenere grandi quantit\u00e0 di copie\u00a0degli acidi nucleici contenuti.\u00a0Pertanto la PCR trova impiego nella diagnostica molecolare di malattie genetiche, del cancro, di malattie infettive, nell\u2019archeologia, nel controllo di contaminazione di microrganismi negli alimenti, e soprattutto nel campo della ricerca scientifica dove ormai \u00e8 ampiamente utilizzata.
Generalmente la PCR comprende una serie ciclica di tre fasi che si svolgono all\u2019interno di un apposito strumento detto thermalcycler: <\/p>\n

    \n
  1. denaturazione tramite calore di due filamenti di DNA;<\/li>\n
  2. ibridazione per raffreddamento con primer in largo eccesso;<\/li>\n
  3. sintesi di nuovo DNA per aggiunta della DNA polimerasi con conseguente allungamento dei primer.<\/li>\n<\/ol>\n

    In linea teorica ogni ciclo\u00a0aumenterebbe la quantit\u00e0 di DNA in modo esponenziale, in realt\u00e0 per avere\u00a0una stima sufficientemente attendibile del numero di filamenti di DNA ottenuti si utilizza la seguente formula: <\/p>\n

    (1 + E)n <\/p>\n

    Dove n<\/strong><\/em> indica il numero di cicli effettuati ed E<\/em> <\/strong>l\u2019efficenza dell\u2019amplificazione (in genere compresa tra 0,7 e 0,8<\/em>).
    La PCR si ottiene aggiungendo in una soluzione contenente il\u00a0DNA stampo, grandi quantit\u00e0 di nucleotidi, delle sequenze primers (corte sequenze di DNA necessari alle attivit\u00e0 delle polimerasi), e una DNA-polimerasi, ovvero un\u2019enzima in grado di sintetizzare una nuova elica di DNA a partire da un\u2019elica stampo.
    Le DNA-polimerasi utilizzate attualmente sono tutte estratte da batteri che vivono in condizioni di temperatura estreme, in modo da essere termostabili. La \u201cTaq\u201d ad esempio, \u00e8 in grado di lavorare ad alte temperature, fino anche a 92\u00b0C, temperatura alla quale avviene il processo di denaturazione del DNA. In passato questa DNA-polimerasi veniva estratta dal Thermophilus aquaticus<\/em>, un batterio che vive nelle acque termali calde; attualmente invece viene prodotta in batteri opportunamente modificati per l\u2019espressione e la sintesi dell\u2019enzima. <\/p>\n

    \"\"<\/p>\n

    Nella prima fase\u00a0 il DNA estratto dalle cellule viene mescolato ad una miscela di reagenti che comprendono sali, nucleotidi, l\u2019enzima Taq polimerasi e le sonde di innesco per l\u2019enzima polimerasi, dette primer. Un primer non \u00e8 altro che un piccolo frammento di DNA a singola elica, lungo circa 20 basi e complementare ad una sequenza di DNA che si vuole amplificare. Esso fornisce all\u2019enzima Taq polimerasi un punto di innesco per la sintesi del nuovo filamento di DNA e ne servono due uno a monte ed uno a valle del tratto che si vuole amplificare. Ciascuno dei due primer si attacca ad un solo filamento. Nell\u2019animazione sono i frammenti rossi e blu.<\/p>\n

    Il primer \u00e8 aggiunto in grande eccesso al DNA. La provetta con la miscela di reagenti \u00e8 posta nella macchina per PCR, capace di cicli successivi di riscaldamento e raffreddamento a temperature specifiche per ogni reazione. Le fasi della PCR si possono cos\u00ec riassumere: <\/p>\n

      \n
    1. \n
      denaturazione del DNA a temperature di 90-95\u00b0C <\/div>\n<\/li>\n
    2. \n
      attacco del primer al sito bersaglio a temperature di 50-60\u00b0C, a seconda del protocollo specifico <\/div>\n<\/li>\n
    3. \n
      \u00a0fase di allungamento, a temperature di 72\u00b0C, ottimali per l\u2019attivit\u00e0 della Taq polimerasi, in cui l\u2019enzima aggiunge nucleotidi all\u2019estremit\u00e0 3\u2019 del primer <\/div>\n<\/li>\n
    4. \n
      \u00a0nuova denaturazione. Poi il ciclo da a) a c) si ripete per 20-30 volte, per finire con un ciclo di allungamento un po\u2019 pi\u00f9 lungo (anche fino a 1 minuto, o 5 minuti per l\u2019amplificazione di loci micorsatelliti). <\/div>\n<\/li>\n
    5. \n
      raffreddamento a 4\u00b0C per bloccare ogni rezione.<\/div>\n<\/li>\n<\/ol>\n

      Attualmente esistono in commercio diversi tipi di PCR che si affiancano alla PCR tradizionale come la Real time PCR, la RT-PCR ( o PCR retro trascrizionale) per quantificare l\u2019RNA in casi di scarsa abbondanza o ancora la LCR dove viene sfruttata l\u2019azione di una ligasi termostabile. <\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"

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