{"id":1307,"date":"2005-04-21T00:00:00","date_gmt":"2005-04-20T22:00:00","guid":{"rendered":""},"modified":"-0001-11-30T00:00:00","modified_gmt":"-0001-11-29T22:00:00","slug":"1307","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.vialattea.net\/content\/1307\/","title":{"rendered":"Vorrei sapere la descrizione del metodo di sequenziamento del DNA sviluppato da Sanger. Cosa permette di determinare? Grazie!!"},"content":{"rendered":"

La sequenziazione (o sequenziamento)\u00a0\u00e8 il processo che permette di ottenere la sequenza di una proteina o di una molecola di acido nucleico. La sequenza del DNA \u00e8 l\u2019insieme di nucleotidi letti nel giusto ordine. Nel DNA sono presenti 4 tipi di nucleotidi, contenenti una delle basi: A, G, C, T.\u00a0 A e G sono purine, C e T sono pirimidine. Se abbiamo un frammento di DNA di 300 nucleotidi e ne vogliamo determinare la sequenza, significa che vogliamo comprendere, nell\u2019ordine esatto, quali sono i 300 nucleotidi. Alla fine del sequenziamento si ottiene un insieme di lettere, es. AAGTGTGTCTGTCAGTTCTAGAACC…, apparentemente prive di significato, in realt\u00e0 a seconda dello studio che si sta effettuando avranno un proprio significato. <\/p>\n

I metodi che si possono utilizzare per sequenziare il DNA sono:
1) Metodo di Maxam e Gilbert
2) Metodo di Sanger
3) Sequenziamento automatico del DNA in fluorescenza<\/p>\n

Il metodo di Maxam e Gilbert prevede la marcatura delle estremit\u00e0 3\u2019 del DNA con 32<\/sup>P, il taglio del DNA e la separazione dei due filamenti identici marcati ad un\u2019estremit\u00e0. Si suddivide la miscela in quattro parti, ciascuna delle quali viene sottoposta ad un diverso trattamento chimico per metilare o\u00a0rimuovere\u00a0specificamente una o due basi. Si producono in questo modo frammenti marcati di dimensione specifica e tramite una elettroforesi \u00e8 possibile determinare l\u2019ordine dei nucleotidi e quindi la sequenza. Questo metodo veniva molto impiegato in passato, ora invece \u00e8 poco utilizzato, perch\u00e9 non adatto al sequenziamento automatico e perch\u00e9 utilizza composti chimici dannosi alla salute. <\/p>\n

Sanger \u00e8\u00a0un biologo inglese vincitore di due premi Nobel: uno ottenuto per aver caratterizzato la struttura dell\u2019insulina, l\u2019altro ricevuto proprio per aver ideato un nuovo metodo di sequenziamento degli acidi nucleici.
Il metodo di Sanger viene anche definito metodo a terminazione di catena o metodo dei dideossinucleotidi. <\/p>\n

Per il sequenziamento con il metodo di Sanger, si preparano in\u00a0quattro provette le mix, costituite da: <\/p>\n

    \n
  1. \n
    Il campione di DNA che si vuole sequenziare a singolo filamento <\/div>\n<\/li>\n
  2. \n
    la DNA polimerasi <\/div>\n<\/li>\n
  3. \n
    un primer marcato con estremit\u00e0 3\u2019OH libera <\/div>\n<\/li>\n
  4. \n
    i quattro tipi di deossinucleotidi trifosfato normali (dNTP) marcati con 32<\/sup>P o 35<\/sup>S <\/div>\n<\/li>\n
  5. \n
    Infine in ogni provetta viene aggiunto uno specifico tipo di dideossinucleotidi trifosfato (ddNTP), in una provetta ddA, in un\u2019altra ddG, in un\u2019altra ddC ed in un\u2019altra ddT, i ddNTP sono la chiave del successo di questa tecnica. <\/div>\n<\/li>\n<\/ol>\n

    Si verifica che il primer complementa con il filamento stampo e viene esteso dalla DNA polimerasi, questa infatti aggiunge all\u2019estremit\u00e0 libera del primer i nucleotidi complementari al filamento stampo, cio\u00e8 i dNTP, invece di aggiungere un dNTP di tanto in tanto pu\u00f2 accadere che aggiunge un ddNTP. Con l\u2019incorporazione del ddNTP la sintesi del filamento complementare si ferma poich\u00e9 i ddNTP non permettono la formazione del legame con il successivo nucleotide trifosfato. I dNTP hanno un 3\u2019OH nello zucchero desossiribosio che consente l\u2019aggiunta di nucleotidi, i ddNTP invece hanno un 3\u2019-H che non consente l\u2019aggiunta di ulteriori nucleotidi e per questo la sintesi del DNA termina.<\/p>\n

    \u00a0<\/p>\n

    \"\"<\/p>\n

    La stessa cosa accade per tutti i frammenti di ciascuna provetta ovvero si ha la sintesi del filamento complementare fino a che non viene incorporato un ddNTP. Si ottengono in questo modo frammenti di DNA di varia lunghezza, che differiscono da provetta a provetta per il tipo di ddNTP con il quale terminano.\u00a0I campioni marcati\u00a0contenuti nelle quattro mix\u00a0vengono poi denaturati al calore e caricati in quattro pozzetti diversi,\u00a0in un gel di poliacrilammide.\u00a0L\u2019elettroforesi viene realizzata a circa 70\u00b0C in presenza di urea in modo da impedire la rinaturazione del DNA. Con l’elettroforesi i frammenti migrano in base alla dimensione e quindi al termine della elettroforesi,\u00a0mediante autoradiografia, \u00e8 possibile risalire alla sequenza.\u00a0 <\/p>\n

    Esempio di gel ottenuto con il metodo di Sanger <\/p>\n

    La sequenza viene letta dal basso del gel\u00a0verso l’alto.\u00a0Nella prima corsia elettroforetica (A), si osservano 3 bande, questo significa che in quelle posizioni \u00e8 stato incorporato un ddATP e quindi significa che in quelle 3 posizioni c\u2019\u00e8 una A nella sequenza. Si procede con lo stesso ragionamento per le altre 3 corsie elettroforetiche che sono indici di dove sono posizionati i nucleotidi C, T, G. In basso \u00e8 riportata la sequenza del filamento.<\/p>\n\n

    \"\"<\/p>\n

    Attualmente esistono metodi di sequenziamento automatico, la sintesi dei filamenti procede come gi\u00e0 descritto prima, per\u00f2 con questa metodica vengono incorporati, per terminare la sequenza, ddNTP marcati con fluorocromi diversi. I prodotti di sintesi vengono fatti correre sulla stessa corsia di un gel denaturante, un laser eccita i fluorocromi, ciascuno dei quali emette una luce d\u2019onda caratteristica e tramite un sistema automatizzato viene riportata su un personal computer la corretta sequenza nucleotidica del frammento analizzato. La procedura \u00e8 completamente automatizzata ed in questo modo si ha un grosso risparmio in termini di tempo, poich\u00e9 si possono analizzare pi\u00f9 campioni simultaneamente. <\/p>\n

    \n

    Da visitare:
    http:\/\/www.bioteach.ubc.ca\/Bioinformatics\/GenomeProjects\/<\/a>
    http:\/\/www.dnalc.org\/shockwave\/cycseq.html<\/a><\/p>\n

    \n

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