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<\/p>\nLa tecnica dell\u2019RNAi deriva dal concetto generale che un RNA, in presenza di una catena di RNA complementare, formi con questo un doppio filamento molto stabile. L\u2019RNA a doppio filamento non viene tradotto e quindi viene abolita la sintesi proteica. La presenza di questa molecola di RNA a doppio filamento della cellula, porta a quell’effetto chiamato di interferenza dell\u2019RNA (RNAi). <\/p>\n
L\u2019effetto RNA interference si \u00e8 osservato per la prima volta in alcune piante di petunia nelle quali era stato transinfettato un gene soprannumerario con un promotore della trascrizione indipendente, allo scopo di intensificarne il colore. Il gene codificava per una proteina uguale a quella gi\u00e0 presente nell\u2019organismo. Il risultato fu alquanto strano, dal momento che le petunie ottenute non presentavano un colore pi\u00f9 intenso ma risultavano screziate e qualche individuo era completamente bianco. Questo fenomeno va sotto il nome di silenziamento genico post trascrizionale (PTGS). <\/p>\n
La spiegazione a questo fenomeno \u00e8 stata trovata solo negli anni \u201990 quando si scopr\u00ec che un RNA a doppio filamento promuoveva la degradazione dell\u2019RNA messaggero. L\u2019effetto RNAi \u00e8 probabilmente un meccanismo molto antico di difesa contro le infezioni da virus a RNA. Probabilmente l\u2019RNA a doppio filamento ricorda alla cellula un genoma virale o un trasposone (trasposoni =\u00a0elementi trasponibili a vita \u2019indipendente\u2019 che sono presenti talvolta nel genoma e che si autoreplicano e si diffondono sia orizzontalmente che verticalmente). <\/p>\n
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Reazioni della cellula all’ingresso di un dsRNA (double stranded = a doppia elica) di origine virale.<\/p>\n
Quindi l\u2019organismo risponde producendo o attivando RNA-endonucleasi che tagliano l\u2019RNA ds in tratti di 21-23 nucleotidi. Sembra che in questo primo\u00a0passo sia coinvolto il gene Dicer, appartenente alla famiglia delle RNase di classe III. Ad un certo stadio inoltre questo segnale di allarme viene amplificato dalla duplicazione dell\u2019RNA estraneo attraverso una RNA polimerasi RNA-dipendente. I frammenti di 21 nucleotidi vengono ulteriormente degradati a duplex di 19-21 nucleotidi, che presentano estremit\u00e0 sporgenti costituite da due nucleotidi. Questi frammenti di RNA prodotti sono a singolo filamento e possono legarsi all\u2019RNA ospite impedendone la traduzione. <\/p>\n
I geni coinvolti nel processo sono ancora poco conosciuti, soprattutto nei mammiferi, per i quali \u00e8 stata al momento trovata una implicazione per un membro della famiglia RDE-1. Alcuni dei geni coinvolti nel processo di RNAi sembrano attivati anche nel caso di distruzione dell\u2019mRNA mediata da sequenze non senso, un meccanismo che permette alle cellule di controllare gli mRNA appena trascritti e di impedire la produzione di proteine difettive. Sembrano essere legati all\u2019effetto RNAi anche tre geni della famiglia SMG. <\/p>\n
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Due schemi esplicativi del meccanismo di azione del RNA a doppio filamento nelle cellule.<\/p>\n
Il metodo dell\u2019RNAi per il silenziamento dei geni \u00e8 stato sviluppato in Cenorhabditis elegans<\/em> nel 1998 (un nematode): La tecnica dell\u2019RNA interference (RNAi) \u00e8 stata usata con successo in molteplici organismi come il moscerino della frutta, in funghi e piante, nel nematode Cenorhabditis elegans<\/em>. Ultimamente \u00e8 stato scoperto che l\u2019effetto RNAi viene utilizzato normalmente da molti organismi. In C. elegans<\/em>, ad esempio esistono dei small temporal RNA (stRNA) che ne regolano lo sviluppo attraverso una repressione transitoria sdi specifici trascritti, questi stRNA vengono prodotti dalla proteina DICER a partire da precursori di circa 70 nucleotidi. Parimenti, sia in Drosophila che nelle cellule HeLa esistono RNA endogeni che causano PTGS e che vengono prodotti dal taglio di trascritti pi\u00f9 lunghi. Nelle cellule di mammifero tuttavia la tecnica classica non ha mai dato risultati soddisfacenti. Inizialmente problemi e insuccessi si sono verificati in generale con i vertebrati, solo in zebrafish nel 1999 si era riusciti a ottenere un silenziamento, se pur solo per alcuni geni. La motivazione del fallimento dell\u2019RNAi nei mammiferi \u00e8 dovuto al fatto che la presenza di RNA a doppio filamento, tipico sintomo di infezione virale, causa una risposta mediata da interferone che blocca la traduzione in maniera aspecifica e porta ad apoptosi della cellula. Negli organismi nei queli l\u2019RNAi funziona invece, l\u2019infezione virale viene combattuta degradando i trascritti virali e quindi impedendone la moltiplicazione.<\/p>\n Esistono due vie di azione dei trascritti lunghi a doppio filamento (dsRNA) nei mammiferi. La prima via prevede che i dsRNA attivino la PKR che fosforila e inattiva il fattore di iniziazione della traduzione. Il secondo pattern coinvolge invece l\u2019attivazione della RNase I che degrada gli mRNA cellulari in maniera indiscriminata.\u00a0\u00c8 stato recentemente scoperto che la via delle PKR non viene attivata da dsRNA di lunghezza inferiore ai 30 nucleotidi, chiamati small interference RNA (siRNA). L\u2019utilizzo di siRNA nelle celllule di mammifero permette il silenziamento genico specifico e il meccanismo \u00e8 cos\u00ec preciso che una sola mutazione dei 21 nucleotidi del siRNA rispetto al mRNA bersaglio annulla quasi completamente il silenziamento. Nei mammiferi resta tuttavia il problema di disegnare i siRNA corretti, dal momento che non tutti sembrano funzionare correttamente. <\/p>\n Per questo motivo sono stati creati vettori in grado di far esprimere small hairpin RNA (shRNA) che vengono processati in vivo a dare molecole di siRNA. I vettori contengono la sequenza del shRNA tra un promotore per la polimerasi III e un sito di terminazione. La scelta della polimerasi III non \u00e8 casuale, dal momento che questo enzima non aggiunge le code di poly-A permettendo quindi al shRNA di ripiegarsi in una struttura a forcina. Un secondo metodo prevede invece cha il vettore contenga due promotori della polimerasi III in grado di creare un filamento antisenso e uno senso, ottenendo direttamente un siRNA di diversi RNAi utilizzando vettori.<\/p>\n Entrambi questi tipi di RNA si legano alla sequenza dell\u2019RNA messaggero (mRNA), a loro complementare, presente nella cellula, rendendone impossibile la traduzione e causandone la degradazione. Il risultato \u00e8 l\u2019annnullamento della sintesi di una determinata proteina bersaglio. <\/p>\n Il metodo vector-based per l\u2019RNA interference rende possibile lo spegnimento di geni in maniera molto specifica nella cellula differenziata e il suo effetto \u00e8 persistente, al contrario dei primi metodi per l\u2019RNAi utilizzati nei mammiferi.<\/p>\n Qui di seguito si trovano alcuni link con spiegazioni pi\u00f9 approfondite:<\/p>\n hal9000.cisi.unito.it\/wf\/DIPARTIMEN\/ Genetica,_\/Attivit–D1\/Biologia-m\/RNAi.ppt<\/a> […]<\/p>\n","protected":false},"author":247,"featured_media":0,"comment_status":"closed","ping_status":"open","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":{"footnotes":""},"categories":[28],"tags":[],"class_list":["post-1306","post","type-post","status-publish","format-standard","hentry","category-biologia-molecolare-e-genetica"],"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/www.vialattea.net\/content\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/1306","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/www.vialattea.net\/content\/wp-json\/wp\/v2\/posts"}],"about":[{"href":"https:\/\/www.vialattea.net\/content\/wp-json\/wp\/v2\/types\/post"}],"author":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.vialattea.net\/content\/wp-json\/wp\/v2\/users\/247"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.vialattea.net\/content\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=1306"}],"version-history":[{"count":0,"href":"https:\/\/www.vialattea.net\/content\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/1306\/revisions"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/www.vialattea.net\/content\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=1306"}],"wp:term":[{"taxonomy":"category","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.vialattea.net\/content\/wp-json\/wp\/v2\/categories?post=1306"},{"taxonomy":"post_tag","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.vialattea.net\/content\/wp-json\/wp\/v2\/tags?post=1306"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}
I piccoli RNAi (siRNA) artificiali utilizzati sono RNA a doppio filamento di 19-21 nucleotidi con estremit\u00e0 che presentano 2 nucleotidi simmetrici sporgenti, preferibilmente due timidine. I siRNA vengono introdotti nelle cellule, dove si associano con proteine specifiche formando complessi ribonucleoproteici che setacciano gli mRNA contenuti nel citoplasma per degradare in maniera selettiva solo quello che contenga la sequenza corrispondente. <\/p>\n![\"\"](\"http:\/\/www.vialattea.net\/spaw\/image\/biologia\/RNAitecniche.gif\")
Produzione <\/p>\n
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