{"id":1249,"date":"2005-03-06T00:00:00","date_gmt":"2005-03-05T23:00:00","guid":{"rendered":""},"modified":"-0001-11-30T00:00:00","modified_gmt":"-0001-11-29T22:00:00","slug":"1249","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.vialattea.net\/content\/1249\/","title":{"rendered":"Nella replicazione della lagging strand, la DNA polimerasi eucariotica non \u00e8 in grado di rimuovere i primer, richiedendo l’intervento della endonucleasi FEN. Due meccanismi coinvolgono l’azione di questa proteina: il ”modello dell’orecchio” e il ”modello della RNasi H”. Vorrei sapere in cosa consistono tali modelli. Grazie"},"content":{"rendered":"
Per rispondere esaurientemente a chi pone questa domanda piuttosto tecnica, senza correre il rischio di scoraggiare altri lettori, sarebbe necessario introdurre alcuni concetti basilari sul meccanismo di replicazione del DNA e sulle propriet\u00e0 degli enzimi ivi coinvolti. Al fine per\u00f2 di evitare inutili ripetizioni, rimando alle seguenti risposte recentemente pubblicate da alcuni nostri esperti: <\/div>\n
\n
http:\/\/www.vialattea.net\/esperti\/php\/risposta.php?num=3088<\/a><\/div>\n
http:\/\/www.vialattea.net\/esperti\/php\/risposta.php?num=6072<\/a><\/div>\n
\u00a0<\/div>\n
Vi si possono trovare, chiaramente descritti, la struttura del DNA, le caratteristiche della DNA polimerasi, i concetti di attivit\u00e0 nucleasica ed il meccanismo di replicazione discontinua del materiale genetico. <\/div>\n
\u00a0<\/div>\n
Poich\u00e8 la domanda concerne la replicazione del cosiddetto “filamento ritardato” (o lagging strand) del DNA, \u00e8 inoltre utile integrare le informazioni generali, fornite nei link riportati sopra, con una breve introduzione pi\u00f9 focalizzata agli eventi che si susseguono durante la replicazione di quest\u2019ultimo.<\/div>\n
\u00a0<\/div>\n
Il “filamento ritardato” del DNA viene sintetizzato in piccoli pezzi di circa 180 nucleotidi (frammenti di Okazaki) che vengono poi uniti fra loro a formare un filamento continuo di DNA. La sintesi di ciascun frammento di Okazaki \u00e8 iniziata dalla DNA polimerasi alfa\/primasi, la quale produce una breve sequenza (in inglese “primer”) di circa trenta paia di basi, dieci delle quali costituite da RNA (acido ribonucleico) ed il resto da DNA (acido deossi-ribonucleico). Il fattore di replicazione C (RF-C) riconosce questo primer misto RNA\/DNA e vi si lega, provocando il distacco della DNA polimerasi alfa\/primasi. A questo punto, la DNA polimerasi delta, aiutata dalla proteina PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen), si lega al primer RNA\/DNA e continua la sintesi del resto del frammento di Okazaki (figura 1).<\/div>\n
\u00a0<\/div>\n
\n
\u00a0\"\"<\/div>\n
\u00a0<\/div>\n
\u00a0Questo scambio fra la DNA polimerasi alfa\/primasi e la DNA polimerasi delta prende il nome di “scambio delle polimerasi” (in inglese “polymerase switch”) e rappresenta un evento fondamentale per la salvaguardia del patrimonio genetico cellulare.
La DNA polimerasi alfa\/primasi \u00e8 l\u2019unica polimerasi in grado d\u2019iniziare dal nulla la sintesi di una catena di DNA, ma \u00e8 anche un enzima a “bassa fedelt\u00e0” che non possiede l\u2019attivit\u00e0 esonucleasica 3\u2019-5\u2019, necessaria per rimuovere nucleotidi erroneamente incorporati nella nascente catena di DNA. La DNA polimerasi alfa\/primasi rischia dunque d\u2019introdurre cambiamenti indesiderati nella sequenza del DNA da essa sintetizzato. Al contrario, la DNA polimerasi delta \u00e8 un enzima ad “alta fedelt\u00e0”, che \u00e8 in grado di riconoscere i nucleotidi erroneamente introdotti e di rimuoverli grazie alla propria attivit\u00e0 esonucleasica 3\u2019-5\u2019. Lo scambio fra polimerasi ha dunque lo scopo di minimizzare gli errori, garantendo che la maggior parte del frammento di Okazaki sia sintetizzato dalla polimerasi ad alta fedelt\u00e0.<\/div>\n
\u00a0<\/div>\n
Ricapitolando, circa 150 dei 180 nucletidi di un frammento di Okazaki vengono sintetizzati dalla polimerasi delta, mentre solo i trenta iniziali dalla polimerasi alfa\/primasi. Di questi trenta, i primi dieci sono costituiti da RNA, che deve essere necessariamente rimosso per garantire l\u2019omogeneit\u00e0 del cromosoma (solo il DNA pu\u00f2 costituire i cromosomi), mentre la ventina seguente, pur essendo costituita da DNA, potrebbe contenere errori accidentalmente introdotti dalla polimerasi alfa\/primasi. La cellula corregge entrambi questi difetti “tagliando” il materiale genetico sintetizzato dalla DNA polimerasi alfa\/primasi grazie all\u2019azione concertata di pi\u00f9 nucleasi, vere e proprie “forbici” in grado di rimuovere pezzi di acidi nucleici (vale qui forse la pena ricordare la differenza fra i due tipi di nucleasi: l\u2019endonucleasi rimuove brevi frammenti tagliando all\u2019interno della catena di acido nucleico (RNA o DNA), mentre l\u2019esonucleasi rimuove i nucleotidi ad uno ad uno, partendo dall\u2019estremit\u00e0 della catena stessa). Il materiale genetico tagliato viene poi sostituito con DNA sintetizzato dalla DNA polimerasi delta ad alta fedelt\u00e0.
Attualmente, non si conosce con certezza il meccanismo preciso di questi ultimi eventi. Per provare a dare un senso ai risultati ottenuti in laboratorio, sono stati proposti due modelli principali. <\/div>\n
    \n
  1. Nel modello “classico” (o dell\u2019RNAsi H1), la DNA polimersi delta, giunta alla sintesi dell\u2019estremit\u00e0 3\u2019 di un filamento di Okazaki, si “scontra” l\u2019estremit\u00e0 5\u2019 del filamento di Okazaki immediatamente adiacente, che \u00e8 ancora costituita dal primer misto RNA\/DNA sintetizzato dalla DNA polimerasi alfa\/primasi (figura 2). Lo “scontro” fra il corpo della DNA polimerasi delta ed il primer RNA\/DNA fa s\u00ec che quest\u2019ultimo venga “scalzato” dalla catena di DNA a cui era appaiato (per intenderci, un po’ come la collisione fra due treni che percorrono lo stesso binario risulta nel deragliamento di uno dei due convogli). Il primer RNA\/DNA \u00e8 ora “un\u2019appendice” (in inglese “flap”) a singola catena e come tale pu\u00f2 essere attaccato dall\u2019endonucleasi RNAsi H1, che lo taglia appena un ribonucleotide prima della giunzione fra RNA e DNA. L\u2019ultimo ribonucletide viene rimosso grazie all\u2019attivit\u00e0 esonucleasica dell\u2019endonucleasi Flap-1 (o FEN-1). Secondo alcuni ricercatori, FEN-1 sarebbe inoltre capace d\u2019individuare nucleotidi sbagliati eventualmente incorporati dalla DNA polimerasi alfa\/primasi nella porzione a DNA del primer e, solo in questo caso, rimuoverebbe anche questo tratto di DNA grazie alla sua attivit\u00e0 endonucleasica. Dopo lo “scontro”, la DNA polimerasi delta continua ad allungare il filamento di Okazaki che stava sintetizzando fino a raggiungere la nuova estremit\u00e0 5\u2019 del frammento di Okazaki adiacente, accorciata dall\u2019azione di RNAsi H1 e FEN-1. A questo punto i due frammenti di Okazaki possono essere legati fra loro grazie all\u2019enzima DNA ligasi. <\/li>\n<\/ol>\n
    \n

    Le osservazioni che:
    a) cellule prive di RNAsi H1 e di FEN-1 sono in grado comunque di completare la maturazione dei filamenti di Okazaki;
    b) la presenza dell\u2019endonucleasi Dna2 \u00e8 essenziale per la replicazione del filamento ritardato del DNA e per la sopravvivenza della cellula hanno portato all\u2019elaborazione di un secondo modello, che differisce solo in parte rispetto al precedente: <\/div>\n

    \u00a0<\/div>\n
      \n
    1. \u00a0Quando, in seguito allo scontro con la DNA polimerasi delta il primer RNA\/DNA viene scalzato dalla catena di DNA a cui era appaiato, esso viene immediatamente legato dalla Proteina di Replicazione A (o RPA, acronimo dell\u2019inglese Replication Protein A). La RPA ha il duplice compito di limitare ai soli trenta nucleotidi del primer il tratto di DNA “flap” a singola elica prodotto (sarebbe infatti controproducente se lo scontro con la DNA polimerasi delta “srotolasse” una porzione troppo lunga del frammento di Okazaki), nonch\u00e9 di favorire il legame al “flap” della endonucleasi Dna2. La Dna2 rimuove, grazie alla sua attivit\u00e0 endonucleasica, la maggior parte del “flap”, lasciandone solo cinque-sette nucleotidi (figura 3). Un “flap” cos\u00ec corto non \u00e8 pi\u00f9 in grado di mantenere legata la RPA, che se ne distacca. A questo punto l\u2019endonucleasi FEN-1 pu\u00f2 legarsi al “flap” completandone il taglio. Come gi\u00e0 descritto sopra, la parte di DNA rimossa viene risintetizzata dalla DNA plomerasi delta ed i due frammenti di Okazaki vengono quindi legati dalla DNA ligasi.\n

      \u00c8 importante notare come, in quest\u2019ultimo modello, FEN-1 possa essere sostituita all\u2019occorrenza da altre endonucleasi quali ExoI o dalla stessa Dna2. Si calcola infatti che, a livello cellulare, almeno la met\u00e0 dei frammenti di Okazaki vengano rimaneggiati da un meccanismo indipendente dall\u2019azione di FEN-1. Ci\u00f2 non deve sorprendere: sviluppare pi\u00f9 soluzioni indipendenti per lo svolgimento di un\u2019unica attivit\u00e0 essenziale alla sopravvivenza non \u00e8 inconsueto per gli organismi viventi… un po’ come viaggiare con la ruota di scorta!<\/li>\n<\/ol>\n

      \u00a0<\/div>\n
      Per chi volesse ulteriormente approfondire l\u2019argomento (in inglese): <\/p>\n

      Maga et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 14298-14303
      Ayyagari et al. (2003) J. Biol. Chem. 278, 1618-1625
      Hwan Jin et al. (2003) J. Biol. Chem. 278, 1626-1633
      Rumbaugh et al. (1999) J. Biol. Chem. 274, 14602-14608
      Murante et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 2244-2249
      Bae et al. (2000) J. Biol. Chem. 275, 38022-38031
      Qiu et al. (1999) Mol. Cell. Biol. 19, 8361-8371
      Hubscher & Seo (2001) Mol. Cells 12, 149-157<\/div>\n<\/div>\n<\/div>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"

      […]<\/p>\n","protected":false},"author":154,"featured_media":0,"comment_status":"closed","ping_status":"open","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":{"footnotes":""},"categories":[28],"tags":[],"class_list":["post-1249","post","type-post","status-publish","format-standard","hentry","category-biologia-molecolare-e-genetica"],"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/www.vialattea.net\/content\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/1249","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/www.vialattea.net\/content\/wp-json\/wp\/v2\/posts"}],"about":[{"href":"https:\/\/www.vialattea.net\/content\/wp-json\/wp\/v2\/types\/post"}],"author":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.vialattea.net\/content\/wp-json\/wp\/v2\/users\/154"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.vialattea.net\/content\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=1249"}],"version-history":[{"count":0,"href":"https:\/\/www.vialattea.net\/content\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/1249\/revisions"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/www.vialattea.net\/content\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=1249"}],"wp:term":[{"taxonomy":"category","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.vialattea.net\/content\/wp-json\/wp\/v2\/categories?post=1249"},{"taxonomy":"post_tag","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.vialattea.net\/content\/wp-json\/wp\/v2\/tags?post=1249"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}