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A partire dagli anni settanta vennero prodotti in fabbrica plasmidi sulla base di quelli esistenti in natura, aggiungendo frammenti di DNA presi da altri organismi, batteri e non. Successivamente il livello di \u201cingegnerizzazione\u201d si \u00e8 sofisticato sempre di pi\u00f9, tanto che oggi si trovano in commercio plasmidi del tutto artificiali. Oltre ai plasmidi batterici (come pBR322) vengono utilizzati per costruire plasmidi anche cromosomi di virus che normalmente infettano i batteri (per esempio Lambda o M13), perch\u00e9 essi sono in grado di inserirsi nel cromosoma batterico e permettono di amplificare frammenti di DNA estraneo molto lunghi (fino a cinquantamila paia di basi). Il termine plasmide si \u00e8 quindi esteso a tutte quelle molecole usate come \u201ctrasportatori\u201d di DNA, che si definiscono quindi anche vettori.
I frammenti di DNA aggiunti in fabbrica sono necessari ad espletare specifiche funzioni, e devono essere disposti in un preciso ordine affinch\u00e9 le funzioni vengano espletate correttamente. <\/p>\n
Qui di seguito vediamo uno schema generico di mappa di vettore di espressione genica, e la mappa di un vettore vero, il pCX-EGFPTM, lungo 5,5 kilobasi (kbp), a titolo di esempio. I numeri tra parentesi indicano il numero della base di inizio del gene o sito di restrizione indicato. EcoRI, PstI, BamHI, SalI sono sigle che indicano i siti per gli enzimi di restrizione. Naturalmente le varianti allo schema fondamentale sono moltissime. <\/p>\n
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Innanzitutto vengono messi dei geni per la resistenza a vari antibiotici, che permettono di selezionare solo quei batteri che hanno recepito il plasmide. I batteri trasformati con il plasmide contenente DNA estraneo vengono fatti crescere su terreni contenenti uno o pi\u00f9 antibiotici, e cos\u00ec solo quelli che hanno il plasmide possono sopravvivere, mentre gli altri muoiono. I geni per la resistenza agli antibiotici sono detti marcatori di selezione.
Altri frammenti aggiunti in fabbrica contengono delle sequenze che permettono il taglio del plasmide usando gli enzimi di restrizione. Il ricercatore pu\u00f2 cos\u00ec aprire il plasmide ed inserirvi il gene estraneo, a sua volta ottenuto grazie ad un taglio con lo stesso enzima di restrizione. In uno stesso plasmide vi sono siti per diversi enzimi di restrizione, per dare pi\u00f9 scelta allo sperimentatore, ma sempre in un\u2019unica copia, per evitare che il plasmide venga tagliuzzato; i siti si trovano di solito concentrati tutti in una stessa zona del plasmide. Vi possono anche essere alcuni altri siti per enzimi di restrizione diversi da quelli per l\u2019inserzione, e disposti in due zone del plasmide, da usare nel caso si volesse rimuovere il gene inserito.
Vi sono poi segnali necessari ad avviare della sintesi di RNA messaggero (mRNA), cio\u00e8 la trascrizione, a partire dal gene estraneo, e segnali di avvio della traduzione di mRNA in catena polipeptidica. Tutti questi segnali, che sono sempre delle sequenze specifiche di nucleotidi, devono trovarsi a monte del gene da esprimere, quindi prima dell\u2019estremit\u00e0 5\u2019 del sito di inserzione del gene.
La sequenza che serve da avvio della trascrizione si chiama promotore. Esso \u00e8 una specifica sequenza di DNA che viene riconosciuta dall\u2019enzima RNA polimerasi, e pu\u00f2 derivare o da batteri, cio\u00e8 da procarioti, se il DNA da utilizzare per la produzione di proteine \u00e8 procariotico, oppure da eucarioti se i geni per le proteine da produrre provengono da organismi superiori diversi dai batteri. Dato l\u2019elevato numero di studi condotti sull\u2019uomo e sul topo, molti plasmidi hanno promotori provenienti da queste due specie, e per l\u2019espressione dei geni vengono utilizzate cellule eucariotiche, per esempio lieviti, cellule di scimmia, di topo, di uomo. Ci\u00f2 si rende necessario in quanto la proteina eucariotica necessita della maturazione del mRNA, e di modificazioni post-traduzionali come l\u2019aggiunta di catene di zuccheri o altri gruppi chimici, o la creazione di ponti disolfuro tra amminoacidi, tutti processi che non possono avvenire nella cellula procariotica.
Vi saranno poi dei segnali di stop dopo l\u2019estremit\u00e0 3\u2019 del gene inserito: prima lo stop della traduzione di mRNA in proteina, e poi lo stop della trascrizione in RNA, il terminatore, in modo da consentire la trascrizione di tutto il gene. Il terminatore \u00e8 costituito da una breve sequenza palindromica posta 15-20 basi prima della fine del trascritto, e da una coda di poli-A.
La maturazione dell\u2019RNA, o splicing, serve ad eliminare le sequenze del gene eucariotico non codificanti (introni) e a cucire tra loro quelle codificanti (esoni). Una volta maturo, l\u2019RNA pu\u00f2 essere tradotto in proteina. <\/p>\n
Le varianti allo schema di base sono moltissime, a seconda delle esigenze di studio.
Nel plasmide possono essere inserite delle piccole code codificanti per amminoacidi particolari (per esempio istidina), sia all\u2019estremit\u00e0 5\u2019 che 3\u2019 del prodotto trascritto. La presenza di code di amminoacidi nella proteina ne permette la efficiente purificazione con metodi specifici.
I vettori di ultima generazione sono ottimizzati anche per una pi\u00f9 efficiente lettura del codice nel giusto frame, cos\u00ec da evitare la produzione di proteine anomale dovuto semplicemente al un errore di lettura del codice genetico. Alcuni portano anche un gene per la luciferasi, una proteina fluorescente, derivante da batteri o insetti, che viene trascritta e sintetizzata insieme a quella di interesse; essa serve a dimostrare l\u2019avvenuto giusto funzionamento del sistema di espressione. Ci\u00f2 permette una verifica immediata dell\u2019espressione, direttamente sulle piastre di coltura delle cellule, in quegli esperimenti dove sia di grande importanza una risposta di tipo positivo o negativo, senza bisogno di fare complesse analisi mirate per verificare la presenza della proteina di interesse. Questi sistemi sono usati anche per studiare i promotori, o gli operatori che regolano l\u2019espressione genica. <\/p>\n
Libri
Biologia Molecolare del Gene. J.D. Watson et al. Ed. Zanichelli.
Ingegneria Genetica E. Boncinelli, A. Simeone, P. Iaccarino Idelson. Ed. Idelson-Gnocchi.
Le biotecnologie. M. Buiatti, Ed. Il Mulino, Collana \u201cFarsi un\u2019idea\u201d, n.65. <\/p>\n
Per la distinzione tra procarioti ed eucarioti: Cercare o amplificare un gene; organismi geneticamente modificati Plasmidi, vettori, ingegneria genetica […]<\/p>\n","protected":false},"author":279,"featured_media":0,"comment_status":"closed","ping_status":"open","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":{"footnotes":""},"categories":[28],"tags":[],"class_list":["post-1246","post","type-post","status-publish","format-standard","hentry","category-biologia-molecolare-e-genetica"],"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/www.vialattea.net\/content\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/1246","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/www.vialattea.net\/content\/wp-json\/wp\/v2\/posts"}],"about":[{"href":"https:\/\/www.vialattea.net\/content\/wp-json\/wp\/v2\/types\/post"}],"author":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.vialattea.net\/content\/wp-json\/wp\/v2\/users\/279"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.vialattea.net\/content\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=1246"}],"version-history":[{"count":0,"href":"https:\/\/www.vialattea.net\/content\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/1246\/revisions"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/www.vialattea.net\/content\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=1246"}],"wp:term":[{"taxonomy":"category","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.vialattea.net\/content\/wp-json\/wp\/v2\/categories?post=1246"},{"taxonomy":"post_tag","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.vialattea.net\/content\/wp-json\/wp\/v2\/tags?post=1246"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}
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