Le tecniche impiegate per il sequenziamento del DNA sono state descritte in una precedente risposta, alla quale rimando per un’introduzione all’argomento (http://www.vialattea.net/esperti/php/risposta.php?num=7252).
La struttura dei nucleotidi utilizzati nelle reazioni di sequenziamento varia:
1. a seconda del tipo di base azotata presente (ovviamente)
2. a seconda del tipo e della posizione della marcatura utilizzata
3. a seconda del numero di gruppi OH presenti sullo zucchero
La struttura “generale” del nucleotide comprende una delle quattro possibili basi azotate (adenina, guanina, citosina, timina), legata al carbonio in posizione 1 dello zucchero deossiribosio. Tre gruppi fosfato, legati al carbonio in posizione 5 del deossiribosio, completano il nucleotide (figura 1, parte B).
Per le reazioni di sequenziamento, questi deossinucleotidi “standard” o dNTP sono inoltre “marcati” con isotopi radioattivi (solitamente fosforo 32P o 33P o zolfo 35S) o con fluorofori (molecole fluorescenti, per esempio rodamina, cianina 3 o 5). L’atomo radioattivo può essere legato, o sostituire il fosforo cosiddetto alfa (figura 2) o gamma. La marcatura in posizione alfa viene utilizzata sia nel sequenziamento classico secondo Sanger sia nella sua variante tramite PCR. La marcatura in posizione gamma è solitamente riservata al sequenziamento Sanger tramite PCR, oppure al sequenziamento Maxam-Gilbert, una tecnica ormai praticamente abbandonata.
Oltre ai deossinucleotidi “standard”, nelle reazioni di sequenziamento vengono utilizzati anche deossinucleotidi “terminatori” o di-deossinucleotidi (ddNTP), che si contraddistinguono per la presenza di solo idrogeno sul carbonio in posizione 3 (3-H) dello zucchero (in questo caso detto di-deossiribosio, figura 1 parte A).
Segnalo inoltre come particolarità che, per riuscire a sequenziare templati contenenti ripetizioni di G-C (G-C stretches), il dGTP (deossiguanosina) viene a volte sostituito nelle reazioni di sequenziamento con degli analoghi quali deossinosina (dITP) o 7-deaza-dGTP (figura 3).
