Come funzionano i test rapidi utilizzati per la diagnosi della BSE

I test rapidi permettono di fare in tempi brevi una prima selezione su campioni sospetti. Un risultato negativo è infatti accettabile come definitivo ma un campione positivo deve poi essere ricontrollato con test più lunghi e più affidabili, che servono di conferma.

Con uno screening di questo tipo si ottiene il duplice scopo di sottoporre ad analisi di conferma solo un numero ridotto di campioni ed anche di poter bloccare subito materiale sospetto.

Per esempio un test rapido in una industria alimentare permette di isolare in poche ore lotti positivi al test (sospetti di essere non conformi) e di dare l’approvazione alla vendita dei lotto conformi.

Concentriamoci sul prione: questa proteina esiste normalmente nel cervello (Pc Pr) ed è coinvolta nella trasmissione dei segnali nervosi. Quando questa proteina viene a contatto con la forma degenerata (Pr Psc) ne assume le struttura e diventa inattaccabile dalle proteasi, enzimi che controllano ed eliminano le proteine malformate o in eccesso.

A questo indirizzo si trova il documento della EU, in data 8 luglio 1999, che stabilisce i criteri cui deve soddisfare ogni Test Rapido per il BSE, per essere accettato come ufficiale.
http://europa.eu.int/comm/food/fs/bse/bse12_en.html
The evaluation of tests for the diagnosis of Transmissible Spongiform Encephalopathy in Bovines (8 July 1999)

Ottimo sito per informazioni tecniche è il sito dell’Isituto Zooprofilattico Sperimentale di Torino, centro di riferimento per la diagnosi definitiva di BSE.  http://www.to.izs.it/  Qui si trova anche il “Protocollo di diagnosi per il sistema nervoso centrale di bovino ed ovino”, cioè il metodo ufficiale per la analisi di conferma.

In questo sito esiste un documento “Linee guida al prelievo dei campioni per il test rapido”. Da questo documento cito
“Metodi rapidi riconosciuti come ufficiali:
test “Prionics”
test “Platelia-BSE”
test “Enfer”
Questi sono test immunobiochimici che ricercano nel tessuto nervoso la proteina patologica associata all’infezione (PrPsc) mediante uso di anticorpi monoclonali.

Come funzionano?

I test vengono eseguiti su materiale fresco o congelato (tronco encefalico).

  • Il test Prionics prevede l’esecuzione di un Western blot su omogenati di encefalo digeriti con Proteinasi K. Il campione è sottoposto ad una corsa elettroforetica in un gel, che consente la stratificazione della PrPsc in tre bande caratteristiche. Le bande sono trasferite su speciali membrane su cui sono rivelate con anticorpi anti-PrPsc. La positività è quindi data dalla comparsa di queste bande proteiche.
  • Il test Platelia è invece un ELISA sandwich. L’omogenato di encefalo, in seguito a digestione con Proteinasi K e a centrifugazione, viene immesso in piastre a 96 pozzetti adsorbite con anticorpi anti-PrP. La positività è svelata con la reazione tra la PrP e un secondo anticorpo coniugato con un enzima in grado di sviluppare una reazione colorimetrica. Viene quindi effettuata la lettura della densità ottica presentata dal pozzetto con il campione in esame: il superamento di un preciso valore soglia di densità ottica è indicativo di positività.
  • Il test Enfer è anch’esso un ELISA: la metodica è quindi simile a quella illustrata per il Platelia. In questo caso però il campione viene fatto reagire con anticorpi anti-PrP coniugati con un enzima che dà luogo ad una reazione di chemiluminescenza. La positività è data dalla lettura ed interpretazione di questa reazione.”

In parole molto semplici sono tutte analisi che identificano una frazione della proteina anomala, il PrPsc, con metodi comunemente usati per la identificazione delle proteine, cioè la reazione con anticorpi specifici.
In questo caso prima di utilizzare il reagente cioè l’anticorpo che si legherà al Prione, si eliminano le proteine presenti nell’omogenato di cervello trattandolo con proteinasi K. Questo enzima degrada le proteine ad eccezione del Pr Psc, che essendo anomalo non viene attaccato. In seguito alla aggiunta di anticorpi specifici anti Pc, avviene la reazione antigene anticorpo con produzione di un precipitato incolore difficilmente valutabile in termini quantitativi.

Il test Prionics è una elettroforesi, processo che applica un campo elettrico sul campione trattato con vitamina K e sullo standard di riferimento, messi su una piastra di gel. Ogni proteina ha una carica elettrica caratteristica e sotto l’influsso del campo elettrico si sposta sulla superficie gel in misura uguale a quella dello standard corrispondente. Dopo contatto con l’anticorpo specifico forma un precipitato, segno della presenza della proteina cercata..
Pre rendere il precipitato più evidente si coniugano all’anticorpo ad esempio gruppi cromogeni o che producano chemioluminescenza. (Vedi precedente risposta sui test immunoenzimatici).

Qui la visibilità della reazione è assicurata, nel caso del test Platelia, dalla comparsa di colore e nel caso di Enfer dalla comparsa di luminosità, in maniera proporzionale alla concentrazione della proteina nel preparato in esame.
Inutile dire che in questi tempi si trovano migliaia di siti che trattano tutti gli aspetti del BSE, compresi i primi test ancora in fase sperimentale che prevedono l’uso di tessuto tonsillare, per rivelare la presenza della malattia nel bovino vivo, quindi senza bisogno di abbattere l’animale sospetto, e ad un stadio precedente al manifestarsi dei sintomi clinici.

Di seguito sono elencati alcuni siti, in cui sono presenti molti link.
 http://www.mad-cow.org/
 http://w3.aces.uiuc.edu/AnSci/BSE/

Da: http://i.cnn.net/cnn/2003/US/12/23/mad.cow/story.madcow.jpg