Vorrei conoscere la struttura dei nucleotidi impiegati nel sequenziamento nucleotidico.

Le tecniche impiegate per il sequenziamento del DNA sono state descritte in una precedente risposta, alla quale rimando per un’introduzione all’argomento (http://www.vialattea.net/esperti/php/risposta.php?num=7252).
La struttura dei nucleotidi utilizzati nelle reazioni di sequenziamento varia:
1.                       a seconda del tipo di base azotata presente (ovviamente)
2.                       a seconda del tipo e della posizione della marcatura utilizzata
3.                       a seconda del numero di gruppi OH presenti sullo zucchero
 
La struttura “generale” del nucleotide comprende una delle quattro possibili basi azotate (adenina, guanina, citosina, timina), legata al carbonio in posizione 1 dello zucchero deossiribosio. Tre gruppi fosfato, legati al carbonio in posizione 5 del deossiribosio, completano il nucleotide (figura 1, parte B).

Per le reazioni di sequenziamento, questi deossinucleotidi “standard” o dNTP sono inoltre “marcati” con isotopi radioattivi (solitamente fosforo 32P o 33P o zolfo 35S) o con fluorofori (molecole fluorescenti, per esempio rodamina, cianina 3 o 5). L’atomo radioattivo può essere legato, o sostituire il fosforo cosiddetto alfa (figura 2) o gamma. La marcatura in posizione alfa viene utilizzata sia nel sequenziamento classico secondo Sanger sia nella sua variante tramite PCR. La marcatura in posizione gamma è solitamente riservata al sequenziamento Sanger tramite PCR, oppure al sequenziamento Maxam-Gilbert, una tecnica ormai praticamente abbandonata.

Oltre ai deossinucleotidi “standard”, nelle reazioni di sequenziamento vengono utilizzati anche deossinucleotidi “terminatori” o di-deossinucleotidi (ddNTP), che si contraddistinguono per la presenza di solo idrogeno sul carbonio in posizione 3 (3-H) dello zucchero (in questo caso detto di-deossiribosio, figura 1 parte A).
Segnalo inoltre come particolarità che, per riuscire a sequenziare templati contenenti ripetizioni di G-C (G-C stretches), il dGTP (deossiguanosina) viene a volte sostituito nelle reazioni di sequenziamento con degli analoghi quali deossinosina (dITP) o 7-deaza-dGTP (figura 3).