I sistemi d’espressione sono degli strumenti biotecnologici utilizzati per ottenere larghe quantità di proteine pure, generalmente importanti dal punto di vista terapeutico, commerciale o della ricerca di base. I vantaggi di questo approccio, rispetto a tecniche più tradizionali come la purificazione di proteine dal loro tessuto d’origine, sono essenzialmente la rapidità, la resa, la sicurezza e la flessibilità.
In poche parole, si tratta d’inserire il gene codificante la proteina d’interesse all’interno di una “cellula ospite“ batterica (procariote), di lievito o di mammifero (eucarioti). Questo DNA estraneo deve essere inoltre posto sotto il controllo di un elemento genetico (il promotore) in grado di essere riconosciuto dalla cellula ospite. La cellula così “ingegnerizzata” produrrà la proteina d’interesse durante la sua fase di crescita, generalmente in quantità molto superiori a quelle rinvenibili naturalmente, facilitando così le successive fasi di purificazione. Le linee cellulari ingegnerizzate possono inoltre essere “coltivate” in laboratorio in fermentatori da centinaia di litri, il che spiega le alte rese ottenibili. E’ inoltre forse utile specificare che, mentre per l’espressione di proteine batteriche si prediligono sistemi procariotici, le proteine eucariotiche possono essere espresse sia in sistemi eucariotici sia in sistemi procariotici.
Sino a qualche decina d’anni fa, i sistemi d’espressione procariotici erano pressochè limitati al batterio Escherichia coli. Oggi, il progresso nella conoscenza della genetica batterica ha reso possibile l’utilizzo di altre specie e sistemi d’espressione basati su Bacillus subtilis e, specialmente, Lactococccus lactis sono attualmente disponibili. E. coli cresce facilmente in laboratorio, duplicandosi rapidamente (nelle migliori condizioni circa ogni 20’-30’); l’approfondita conoscenza della sua genetica e fisiologia cellulare e la disponibiltà dei necessari strumenti molecolari (promotori e plasmidi) ne hanno storicamente fatto un sistema d’espressione molto conveniente. Poichè i procarioti non posseggono il sistema di processamento dell’RNA messaggero tipico degli eucarioti superiori, nel caso la proteina da esprimere sia d’origine eucariotica, è essenziale che il DNA che la codifica sia sotto forma di cDNA. Questo cDNA viene inserito (o clonato) sotto il controllo di un promotore batterico al’interno di un vettore d’espressione (vedi http://www.vialattea.net/esperti/php/risposta.php?num=7013), che viene poi a sua volta inserito (o trasformato) in molteplici copie nella cellula batterica. L’espressione della proteina d’interesse viene generalmente indotta ad un appropriato momento della crescita cellulare grazie all’aggiunta al terreno di coltura di composti chimici che stimolano il promotore. La presenza di molte copie del vettore d’espressione in ciascuna cellula e la capacità di E. coli di crescere ad alta densità (alto numero di cellule per litro di coltura), ne fanno un sistema d’espressione caratterizzato da una grande resa ed economicità. L’esempio forse più significativo dell’utilizzo di E. coli come sistema d’espressione applicato alla biotecnologia è quello della produzione d’insulina umana per il trattamento di pazienti diabetici (commercializzata da Eli Lilly con il nome di Humulin). L. lactis è un microrganismo comunemente usato nell’industria casearia per la conservazione e la fermentazione di latticini. Il suo utilizzo nella filiera alimentare lo rende un batterio generalmente considerato sicuro per l’uomo, da qui l’interesse nel suo sviluppo come sistema per l’espressione di proteine d’importanza terapeutica, come antigeni virali per la produzione di vaccini e citochine umane.
Nonostante la maggior parte delle proteine eucariotiche possano essere espresse in sistemi batterici, esistono eccezioni: per esempio, i procarioti non posseggono membrane intracellulari e non sono quindi generalmente indicati per l’espressione di proteine di membrana. Essi inoltre sono incapaci di portare a termine certe modificazioni a cui alcune proteine eucariotiche vanno naturalmente incontro (per es. la glicosilazione). In questi casi, si preferisce dunque esprimere la proteina eucariotica in un sistema eucariotico, come i lieviti o le cellule di mammifero.
Fra i sistemi d’espressione eucariotici unicellulari, il lievito Saccharomyces cerevisiae è quello storicamente più utilizzato. Così come L. lactis, S. cerevisiae è un microrganismo presente nella nostra filiera alimentare (panificazione) e perciò considerato sicuro, cresce facilmente nelle condizioni di laboratorio con tempi di duplicazione medi di circa 1- 2 ore, la sua genetica è ben conosciuta e numerosi vettori d’espressione sono disponibili. Insomma, pur essendo un eucariote, raggruppa in sé molti dei vantaggi dei sistemi d’espressione procariotici. Anche nel caso dei lieviti, il cDNA codificante la proteina d’interesse deve essere preventivamente clonato in un vettore d’espressione (per ragioni di rapidità questo passaggio viene normalmente eseguito in E. coli), sotto il controllo di un promotore genico di lievito. Il plasmide viene poi trasferito all’interno della cellula di S. cerevisiae. A seconda della sua tipologia, il plasmide potrà integrarsi nel cromosoma della cellula (vettore integrativo) o persistere come unità indipendente (vettore episomale). I vettori integrativi sono molto stabili (cioè non subiscono rimodellamenti e vengono trasmessi di generazione in generazione assieme al cromosoma cellulare) ma sono presenti in una sola copia per cellula. Al contrario, i vettori episomali sono presenti in molteplici copie per cellula, ma la loro ripartizione da cellula madre a cellula figlia al momento della divisione cellulare non è sempre uniforme, col rischio potenziale d’assistere ad un graduale declino del numero di copie col passare delle generazioni. La scelta di un vettore integrativo privilegia dunque la stabilità d’espressione, mentre quella di un plasmide episomale favorisce la resa. Negli ultimi decenni, altre specie oltre a S. cerevisiae hanno trovato crescente uso per l’espressione di proteine, in particolare i lieviti metilotrofi (cioè capaci d’utilizzare il metanolo come fonte di carbonio) e fra questi Pichia pastoris. Il vantaggio di questa specie consiste nella capacità di crescere ad alte densità cellulari su di un terreno di coltura poco costoso, con livelli d’espressione della proteina d’interesse che possono toccare i grammi/litro. Tra le proteine prodotte a partire da sistemi d’espressione di lievito si trovano antigeni virali e batterici (virus epatite B e C. tetani), citochine e fattori della crescita umani (tumor necrosis factor o TNF; epidermal growth factor o EGF), agenti trombolitici (streptochinasi) e soprattutto una nuova generazione d’insulina a rapida azione (NovoLog, commercializzata da Novo Nordisk).
Le cellule di mammifero sono un sistema d’espressione tecnicamente complesso, costoso, caratterizzato da basse rese e lunghi tempi d’attesa. Esse sono dunque generalmente utilizzate solo in casi particolari, come per la produzione di proteine d’origine umana per le quali sia di primaria importanza che la proteina prodotta sia del tutto simile a quella naturale (es. citocromi P450) o in caso di fallimento dei sistemi batterici e di lievito. Il cDNA codificante la proteina d’interesse deve essere preventivamente clonato o in un vettore d’espressione, che viene poi trasferito (transfettato) nella cellula eucariotica, oppure all’interno del genoma di un virus, che viene poi utilizzato per infettare le cellule. L’espressione della proteina d’interesse può, a seconda del sistema prescelto, avvenire in maniera transitoria o stabile. L’espressione transitoria è conseguenza dell’uso di plasmidi d’espressione instabili, che vengono gradualmente perduti dalle cellule (per esempio, vettori contenenti l’origine di replicazione del virus SV40), oppure di virus che, una volta infettate le cellule, finiscono per provocarne la morte (per esempio, vaccinia virus).
L’espressione stabile si ottiene utilizzando vettori d’espressione che persistono indefinitamente all’interno della cellula, sia per integrazione nel cromosoma cellulare sia come entità indipendenti (vettori basati sul virus Epstein-Barr).
Un caso particolare d’uso di cellule di mammifero per la produzione di proteine di grande importanza terapeutica è quello degli ibridomi. Gli ibridomi sono linee cellulari ingegnerizzate al fine di produrre anticorpi. Animali da laboratorio vengono esposti all’agente (antigene) contro il quale si vogliono produrre anticorpi. Trascorso il periodo d’immunizzazione, i linfociti di tipo B (naturalmente incaricati della produzione anticorpale) vengono rimossi dalla milza dell’animale e fusi con cellule tumorali di mieloma. In questo modo si ottiene una nuova linea cellulare “ibrida” in grado di crescere indefinitamente (caratteristica apportata dalle cellule tumorali) e di produrre anticorpi (caratteristica apportata dai linfociti B). Gli anticorpi così prodotti possono essere isolati e divenire strumenti per il trattamento di malattie del sistema immunitario (per es. leucemie, linfomi, AIDS o per prevenire il rigetto d’organi trapiantati).
Tra i sistemi d’espressione eucariotici ha trovato larghe applicazioni, sinora solo nel campo della ricerca di base, l’utilizzo di cellule d’insetto (solitamente S. frugiperda). Il cDNA codificante la proteina d’interesse viene clonato all’interno del genoma di virus specifici (indicati col nome generico di baculovirus), che vengono poi usati per infettare le cellule d’insetto. Questo sistema, come per l’espressione in cellule di mammifero, è abbastanza complesso, soprattutto nella fase di generazione dei virus ricombinanti, ma è caratterizzato, contrariamente alle cellule di mammifero, da alte rese.
Mi rendo conto che la risposta possa, in alcuni passaggi, apparire didascalica. Data la vastità della materia ho cercato di riassumere i tratti salienti dei vari sistemi, senza entrare direttamente nei loro aspetti più tecnici. Spero che questo susciti ulteriori curiosità.
Per approfondire alcuni argomenti (in inglese):
10 years of the nisin-controlled gene expression system (NICE) in Lactococcus lactis. Mierau et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. (2005), 68, 705-717
Recombinant DNA technology as an investigative tool in drug metabolism research. Friedberg & Wolf, Ad. Drug Del. Rev. (1996), 22, 187-213
Human antibodies for immunotherapy development generated via a human B cell hybridoma technology. Li et al., Proc. Natl. Acad. USA (2006), 103, 3557-3562